GB 5009.285-2022 食品安全國家標準 食品中維生素B12的測定

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１

前 言

本標準代替ＧＢ５４１３．１４—２０１０《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素Ｂ１２的測定》。本標準與ＧＢ５４１３．１４—２０１０相比，主要變化如下：

——增加了第一法液相色譜法；

——增加了第二法液相色譜質(zhì)譜法；

——刪除了規(guī)范性引用文件；

——修改了原微生物法為第三法。

食品安全國家標準食品中維生素犅１２的測定

１范圍

本標準規(guī)定了食品中維生素Ｂ１２的測定方法。

第一法液相色譜法適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品、肉及肉制品中維生素Ｂ１２的測定。

第二法液相色譜質(zhì)譜法適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果凍、飲料中維生素Ｂ１２的測定。

第三法微生物法適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品中維生素Ｂ１２的測定。

第一法 液相色譜法

２原理

試樣經(jīng)酶解后，用氰化鉀（或氰化鈉）溶液將鈷胺素異構(gòu)體（羥鈷胺素、甲鈷胺素和５脫氧腺苷鈷胺素等）轉(zhuǎn)化為氰鈷胺素。樣液通過免疫親和柱凈化、濃縮后，反相液相色譜柱分離，紫外檢測器檢測，外標法定量。

３試劑和材料

除非另有說明，所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６８２規(guī)定的一級水。

３．１試劑

３．１．１無水乙酸鈉（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）。

３．１．２乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）。３．１．３甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色譜級。３．１．４乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色譜級。

３．１．５三氟乙酸（ＣＦ３ＣＯＯＨ）：色譜級。

３．１．６氰化鉀或氰化鈉（ＫＣＮ／ＮａＣＮ）。

３．１．７胃蛋白酶（ＣＡＳ號：９０１７５６，活力≥４０Ｕ／ｍｇ）。

３．１．８淀粉酶（活力≥５０Ｕ／ｍｇ）。

３．１．９乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。

３．２試劑配制

３．２．１乙醇溶液（２５％）：量?。玻担埃恚桃掖迹铀♂屩粒保埃埃恚?，混勻。

３．２．２乙酸鈉緩沖液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）：稱?。玻埃担鐭o水乙酸鈉，用９５０ｍＬ水溶解并用乙酸調(diào)ｐＨ至４．０

±０．１，用水稀釋至１００ｍＬ。

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３．２．３氰化鉀（或氰化鈉）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）：稱取１．０ｇ氰化鉀（或氰化鈉）固體，加適量水溶解，并用水稀釋至１０ｍＬ。

注：氰化鉀（或氰化鈉）為劇毒化學品；操作者須帶防護用具，在通風櫥內(nèi)進行氰化鉀（或氰化鈉）溶液的配制或

使用。

３．２．４三氟乙酸溶液（０．０４％，體積比）：量取５０ｍＬ水，加入２０μＬ三氟乙酸，混勻。

３．３標準品

維生素Ｂ１２（氰鈷胺素）標準品（Ｃ６３Ｈ８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ，ＣＡＳ號：６８１９９）：純度≥９％，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準品。

３．４標準溶液配制

３．４．１維生素Ｂ１２標準儲備液（１ｍｇ／ｍＬ）：稱取１０ｍｇ（精確至０．０１ｍｇ）維生素Ｂ１２標準品于５０ｍＬ燒杯中，用乙醇溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶，于－２０℃下避光保存，有效期６個月。

３．４．２維生素Ｂ１２標準工作液（１０μｇ／ｍＬ）：吸取１．０ｍＬ維生素Ｂ１２標準儲備液，置于１０ｍＬ容量瓶

中，用乙醇溶液定容至刻度。轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，于４℃下避光保存，有效期１個月。

３．４．３維生素Ｂ１２標準系列工作溶液：準確吸取標準工作液３０μＬ、６０μＬ、９０μＬ、１５０μＬ和２０μＬ，分別置于１０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。其濃度分別為：３０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ和２０ｎｇ／ｍＬ。臨用現(xiàn)配。

３．５材料

３．５．１維生素Ｂ１２免疫親和柱，柱容量≥８０ｎｇ，柱回收率≥８５％（驗證方法參見附錄Ａ）。

３．５．２玻璃纖維濾紙。

３．５．３微孔濾膜：水相，０．２μｍ。

４儀器和設備

４．１液相色譜儀：帶紫外檢測器。

４．２天平：感量為０．０１ｇ、０．０１ｇ和０．０００１ｇ。

４．３ｐＨ計：精度０．０１。

４．４水浴恒溫振蕩器：溫度范圍２５℃～１０℃。

４．５超聲波清洗器。

４．６離心機：轉(zhuǎn)速≥１０００ｒ／ｍｉｎ。

５分析步驟

注：操作過程應避免紫外光照，并盡可能避光操作。

５．１樣品前處理

５．１．１試樣制備

固體樣品粉碎、研磨，或用絞肉機制成食糜，均質(zhì)混勻。液體樣品試驗前振搖混勻。

２

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５．１．２樣品提取

稱?。担纭保埃缭嚇樱ň_至０．０１ｇ）于１５０ｍＬ具塞錐形瓶中，依次加入３０ｍＬ乙酸鈉緩沖液、０．２ｇ胃蛋白酶、０．０５ｇ淀粉酶和２ｍＬ氰化鉀（或氰化鈉）溶液，充分混合。將樣品溶液放入水浴恒溫振蕩器，在３７℃，酶解３０ｍｉｎ（肉類樣品酶解１０ｈ～１６ｈ），酶解后轉(zhuǎn)入１０℃水浴中，保持３０ｍｉｎ，取出冷卻至室溫。將樣品溶液轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。移取上述溶液４０ｍＬ至５０ｍＬ離心管中，在１０００ｒ／ｍｉｎ下離心１０ｍｉｎ，取上清液用玻璃纖維濾紙過濾后備用。

注：對于以氰鈷銨素為營養(yǎng)強化劑，且本底中不含有其他形式鈷胺素的樣品，在樣品提取時可不使用氰化鉀（或氰

化鈉）。

５．１．３凈化

將免疫親和柱連接至固相萃取裝置上，棄去免疫親和柱內(nèi)的緩沖液后，移取適量上述濾液（其中含維生素Ｂ１２為１０ｎｇ～５０ｎｇ）過柱，調(diào)節(jié)過柱速度為２ｍＬ／ｍｉｎ～３ｍＬ／ｍｉｎ。待樣液完全過柱后，用１０ｍＬ水以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱，抽干。在免疫親和柱下放置１０ｍＬ玻璃試管，用３ｍＬ甲醇分３次洗脫，收集全部洗脫液，在６０℃以下用氮氣流緩緩吹至近干，用０．０４％三氟乙酸溶液定容至１．０ｍＬ，渦旋３０ｓ溶解殘留物，０．２μｍ濾膜過濾，待測。

注：氰化鉀（或氰化鈉）廢液嚴禁與酸混合，可加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)ｐＨ＞１０，再加入高錳酸鉀粉末（按廢液質(zhì)量的３％

加入），使氰化物分解，放置２４ｈ后排放。

５．２液相色譜參考條件

５．２．１色譜柱：Ｃ１８柱（柱長１５０ｍｍ，柱內(nèi)徑４．６ｍｍ，填料粒徑２．５μｍ），或相當者。

５．２．２流動相：Ａ相，０．０４％三氟乙酸溶液；Ｂ相，乙腈。

５．２．３梯度洗脫：０ｍｉｎ～６．０ｍｉｎ，９０％Ａ；６．０ｍｉｎ～８．５ｍｉｎ，９０％～０％Ａ；８．５ｍｉｎ～１４．０ｍｉｎ，９０％Ａ。

５．２．４流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。

５．２．５柱溫：４０℃。５．２．６進樣體積：１０μＬ。５．２．７檢測波長：３６１ｎｍ。

５．３標準曲線的制作

將標準系列溶液由低濃度到高濃度依次注入液相色譜儀中，測定相應的色譜峰面積，以維生素Ｂ１２的峰面積為縱坐標，以維生素Ｂ１２的濃度為橫坐標繪制標準曲線。液相色譜圖見附錄Ｂ中圖Ｂ．１。

５．４樣品測定

將待測樣液注入液相色譜儀中，得到待測溶液中維生素Ｂ１２的峰面積，根據(jù)標準曲線得到測定液中維生素Ｂ１２的濃度。待測樣液中維生素Ｂ１２的響應值應在標準曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應稀釋上機溶液，或調(diào)整取樣量重新按樣品分析步驟處理后再進樣分析。

５．５空白試驗

不稱取試樣，按樣品分析步驟操作，應不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

６分析結(jié)果的表述

試樣中維生素Ｂ１２（以氰鈷胺素計）的含量按式（１）計算：

３

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式中：

ρ×犞１×犞３×１０

犡＝

犿×犞２×１００

……（１）

犡 ——試樣中維生素Ｂ１２的含量，單位為微克每百克（μｇ／１０ｇ）；

ρ ——由標準曲線得到的試樣溶液中維生素Ｂ１２的濃度，單位為納克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；

犞１ ——樣品提取液的定容體積，單位為毫升（ｍＬ）；

犞３ ——試樣過柱洗脫液的最終定容體積，單位為毫升（ｍＬ）；

１０——換算系數(shù)；

犿 ——試樣的取樣量，單位為克（ｇ）；

犞２ ——上柱溶液的體積，單位為毫升（ｍＬ）；

１００——換算系數(shù)。

計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

７精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的１５％。

８其他

當取樣量為５．０ｇ時，嬰幼兒食品和乳品、肉與肉制品的檢出限為０．２μｇ／１０ｇ，定量限為０．５μｇ／１０ｇ。

第二法 液相色譜質(zhì)譜法

９原理

試樣經(jīng)酶解后，用氰化鉀（或氰化鈉）溶液將鈷胺素異構(gòu)體（羥鈷胺素、甲鈷胺素和５脫氧腺苷鈷胺素等）轉(zhuǎn)化為氰鈷胺素。樣液通過免疫親和柱凈化、濃縮后，反相液相色譜柱分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測，同位素內(nèi)標法定量。

１０試劑和材料

除非另有說明，所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６８２規(guī)定的一級水。

１０．１試劑

１０．１．１無水乙酸鈉（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）。１０．１．２氫氧化鈉（ＮａＯＨ）。１０．１．３乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）。１０．１．４乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色譜純。

１０．１．５乙酸銨（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）：色譜純。

１０．１．６氰化鉀或氰化鈉（ＫＣＮ／ＮａＣＮ）。

１０．１．７胃蛋白酶（ＣＡＳ號：９０１７５６，活力≥４０Ｕ／ｍｇ）。

４

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１０．１．８淀粉酶（活力≥５０Ｕ／ｍｇ）。

１０．１．９乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。

１０．２試劑配制

１０．２．１乙醇溶液（２５％）：量?。玻担埃恚桃掖?，加水稀釋至１００ｍＬ，混勻。

１０．２．２乙酸鈉緩沖液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）：稱?。玻埃担鐭o水乙酸鈉，用９５０ｍＬ水溶解并用乙酸調(diào)ｐＨ至４．０

±０．１，用水稀釋至１００ｍＬ。

１０．２．３氰化鉀（或氰化鈉）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）：稱?。保埃缜杌洠ɑ蚯杌c）固體，加適量水溶解，并用水稀釋至１０ｍＬ。

注：氰化鉀（或氰化鈉）為劇毒化學品，操作者須帶防護用具，在通風櫥內(nèi)進行氰化鉀（或氰化鈉）溶液的配制或

使用。

１０．２．４氫氧化鈉溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：稱?。矗埃鐨溲趸c，加適量水溶解，并用水稀釋至１０ｍＬ。１０．２．５乙酸銨溶液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）：稱?。埃保梗缫宜徜@，加適量水溶解，并用水稀釋至１００ｍＬ。１０．２．６乙腈溶液（９０％，體積比）：量取１０ｍＬ水加于９０ｍＬ乙腈中，混勻，超聲脫氣。

１０．３標準品

１０．３．１維生素Ｂ１２（氰鈷胺素）標準品（Ｃ６３Ｈ８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ，ＣＡＳ號：６８１９９）：純度≥９％，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準品。

１０．３．２維生素Ｂ１２同位素內(nèi)標溶液（１３Ｃ７Ｃ６３Ｈ８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ）：１μｇ／ｍＬ甲醇溶液。

１０．４標準溶液配制

１０．４．１維生素Ｂ１２標準儲備溶液（１ｍｇ／ｍＬ）：稱?。保埃恚纾ň_至０．０１ｍｇ）維生素Ｂ１２標準品于５０ｍＬ燒杯中，用乙醇溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至１０ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶，于－２０℃下避光保存，有效期６個月。

１０．４．２維生素Ｂ１２標準中間溶液（１０μｇ／ｍＬ）：吸?。保埃恚叹S生素Ｂ１２標準儲備溶液，置于１０ｍＬ容

量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，于４℃下避光保存，有效期１個月。

１０．４．３維生素Ｂ１２標準工作溶液（０．２μｇ／ｍＬ）：吸?。保埃恚叹S生素Ｂ１２標準中間溶液，置于５０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，于４℃下避光保存，有效期一周。

１０．４．４ 維生素Ｂ１２同位素內(nèi)標工作液（５０ｎｇ／ｍＬ）：吸?。埃担恚叹S生素Ｂ１２同位素內(nèi)標溶液

（１μｇ／ｍＬ），置于１０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，于４℃下避光保存。１０．４．５標準系列溶液：分別準確移取０．２μｇ／ｍＬ的維生素Ｂ１２標準工作溶液１０μＬ、２５μＬ、５０μＬ、１２５μＬ、２５０μＬ和５０μＬ于１ｍＬ容量瓶中，各加入１０μＬ同位素內(nèi)標工作液（５０ｎｇ／ｍＬ），用水定容至刻度，搖勻。其中，維生素Ｂ１２的濃度分別為２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ和１０ｎｇ／ｍＬ。維生素Ｂ１２同位素內(nèi)標的濃度為５ｎｇ／ｍＬ。臨用現(xiàn)配。

１０．５材料

１０．５．１維生素Ｂ１２免疫親和柱，柱容量≥８０ｎｇ，柱回收率≥８５％（驗證方法參見附錄Ａ）。

１０．５．２玻璃纖維濾紙。

１０．５．３微孔濾膜：水相，０．２μｍ。

１ 儀器和設備

１．１液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧電離源（ＥＳＩ）。

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１．２天平：感量為０．０１ｇ、０．０１ｇ和０．０００１ｇ。

１．３ｐＨ計：精度０．０１。

１．４水浴恒溫振蕩器：溫度范圍２５℃～１０℃。

１．５超聲波清洗器。

１．６離心機：轉(zhuǎn)速≥１０００ｒ／ｍｉｎ。

１２分析步驟

注：操作過程應避免紫外光照射，并盡可能避光操作。

１２．１樣品前處理

１２．１．１試樣制備

固體樣品需粉碎、研磨，或用絞肉機制成食糜，均質(zhì)混勻。液體樣品測定前振搖混勻。

１２．１．２提取

１２．１．２．１嬰幼兒食品和乳品、肉與肉制品、烘焙食品、即食谷物

稱取混勻后的試樣１ｇ～５ｇ（精確至０．０１ｇ）于５０ｍＬ離心管中，依次加入１０μＬ同位素內(nèi)標工作液、２５ｍＬ乙酸鈉緩沖液、０．０４ｇ胃蛋白酶、０．０１ｇ淀粉酶和２ｍＬ氰化鉀（或氰化鈉）溶液，充分混合。將樣品溶液放入水浴恒溫振蕩器，在３７℃下，振蕩酶解３０ｍｉｎ（肉類樣品需酶解１０ｈ～１６ｈ），酶解后轉(zhuǎn)入１０℃水浴中，保持３０ｍｉｎ，取出冷卻至室溫。在１０００ｒ／ｍｉｎ下離心１０ｍｉｎ，取上清液用玻璃纖維濾紙過濾后備用。

１２．１．２．２飲料

稱取混勻后的試樣２５ｇ（精確至０．０１ｇ）于５０ｍＬ離心管中，加入１０μＬ同位素內(nèi)標工作液，用氫氧化鈉溶液調(diào)ｐＨ至５～７（碳酸飲料需在超聲波振蕩器中脫氣１０ｍｉｎ后再調(diào)ｐＨ），在１０００ｒ／ｍｉｎ下離心１０ｍｉｎ，取上清液用玻璃纖維濾紙過濾后備用。

１２．１．２．３果凍

稱取混勻后的試樣５ｇ（精確至０．０１ｇ）于５０ｍＬ離心管中，加入１０μＬ同位素內(nèi)標工作液，加入４０ｍＬ水，渦旋混勻，于７０℃水浴中溶解試樣，于５０℃水浴超聲２０ｍｉｎ，用氫氧化鈉溶液調(diào)ｐＨ至５～７，在１０００ｒ／ｍｉｎ下離心１０ｍｉｎ，取上清液用玻璃纖維濾紙過濾后備用。

注：對于以氰鈷銨素為營養(yǎng)強化劑，且本底中不含有其他形式鈷胺素的試樣，在樣品提取時可不使用氰化鉀（或氰

化鈉）。

１２．１．３凈化

將免疫親和柱連接至固相萃取裝置上，棄去免疫親和柱內(nèi)的緩沖液后，轉(zhuǎn)移全部濾液過柱，調(diào)節(jié)過柱速度為２ｍＬ／ｍｉｎ～３ｍＬ／ｍｉｎ。待樣液完全過柱后，用１０ｍＬ水以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱，抽干。在免疫親和柱下放置１０ｍＬ玻璃試管，用３ｍＬ甲醇分３次洗脫，收集全部洗脫液，在６０℃以下用氮氣流緩緩吹至近干，用乙酸銨溶液定容至１．０ｍＬ，渦旋３０ｓ溶解殘留物，０．２μｍ濾膜過濾，待測。

注：氰化鉀（或氰化鈉）廢液嚴禁與酸混合，可加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)ｐＨ＞１０，再加入高錳酸鉀粉末（按廢液質(zhì)量的３％

加入），使氰化物分解，放置２４ｈ后排放。

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１２．２儀器參考條件

１２．２．１液相色譜參考條件

１２．２．１．１色譜柱：Ｃ１８柱（柱長１０ｍｍ，柱內(nèi)徑２．１ｍｍ，填料粒徑１．７μｍ），或相當者。

１２．２．１．２流動相：Ａ相，乙酸銨溶液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）；Ｂ相，乙腈溶液（９０％，體積比）。

１２．２．１．３洗脫梯度：０ｍｉｎ～０．５ｍｉｎ，９３％Ａ；０．５ｍｉｎ～２．０ｍｉｎ，９３％～８５％Ａ；２．０ｍｉｎ～２．５ｍｉｎ，８５％～１０％Ａ；２．５ｍｉｎ～３．０ｍｉｎ，１０％Ａ；３．０ｍｉｎ～３．５ｍｉｎ，１０％～９３％Ａ；３．５ｍｉｎ～６．０ｍｉｎ，９３％Ａ。

１２．２．１．４流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ。

１２．２．１．５柱溫：４０℃。

１２．２．１．６進樣體積：１０μＬ。

１２．２．２質(zhì)譜參考條件

１２．２．２．１電離方式：ＥＳＩ＋。１２．２．２．２離子源溫度：３５０℃。１２．２．２．３錐孔反吹氣流量：５０Ｌ／ｈ。１２．２．２．４脫溶劑氣溫度：６５０℃。１２．２．２．５脫溶劑氣流量：９０Ｌ／ｈ。

１２．２．２．６多反應監(jiān)測（ＭＲＭ）模式，錐孔電壓和碰撞能量見表１，譜圖見附錄Ｃ中圖Ｃ．１。

表１離子對參考條件

化合物名稱

母離子［Ｍ＋２Ｈ］２＋

犿／狕

碎片離子［Ｍ＋Ｈ］＋

犿／狕

錐孔電壓

Ｖ

碰撞能量

ｅＶ

維生素Ｂ１２

６７８．７

１４７．１ａ

３０

３０

３５９．２

２０

維生素Ｂ１２同位素內(nèi)標

６８２．１

１５３．９ａ

３０

３０

３６５．８

２０

ａ定量離子。

１２．３定性測定

在相同的測試條件下，試樣溶液中目標化合物的保留時間與相應標準溶液中目標化合物的保留時間相比，偏差在±２．５％以內(nèi)，且檢測到的離子相對豐度，應當與濃度相當?shù)男Ｕ龢藴嗜芤合鄬ωS度一致，其允許偏差應符合表２的要求。

表２定性時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度

＞５０％

＞２０％～５０％

＞１０％～２０％

≤１０％

允許相對偏差

±２０％

±２５％

±３０％

±５０％

１２．４標準曲線的制作

將標準系列溶液由低濃度到高濃度依次注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定相應的色譜峰面積，以

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維生素Ｂ１２與其同位素內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，以維生素Ｂ１２的濃度為橫坐標繪制標準曲線。

１２．５樣品測定

將待測樣液注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到待測溶液中維生素Ｂ１２與其同位素內(nèi)標的峰面積比值，根據(jù)標準曲線得到待測液中維生素Ｂ１２的濃度。待測液中維生素Ｂ１２的響應值應在標準曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應減少取樣量，重新按樣品分析步驟處理后再進樣分析。

１２．６空白試驗

不稱取試樣，按樣品分析步驟操作，應不含有干擾待測組分的物質(zhì)。

１３分析結(jié)果的表述

犡＝

試樣中維生素Ｂ１２（以氰鈷胺素計）的含量按式（２）計算：

式中：

ρ×犞×１０

犿×１００

……（２）

犡 ——試樣中維生素Ｂ１２的含量，單位為微克每百克（μｇ／１０ｇ）；

ρ ——由標準曲線得到的試樣溶液中維生素Ｂ１２的濃度，單位為納克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；

犞 ——試樣過柱洗脫液的定容體積，單位為毫升（ｍＬ）；

１０ ——換算系數(shù)；

犿 ——試樣的取樣量，單位為克（ｇ）；

１００——換算系數(shù)。

計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

１４精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的１５％。

１５其他

當取樣量為５．０ｇ時，嬰幼兒食品和乳品、肉與肉制品、烘焙食品、即食谷物的檢出限為

０．０５μｇ／１０ｇ，定量限為０．２μｇ／１０ｇ。

當取樣量為２５．０ｇ時，飲料的檢出限為０．０５μｇ／１０ｇ，定量限為０．０２μｇ／１０ｇ。

當取樣量為５．０ｇ時，果凍的檢出限為０．０３μｇ／１０ｇ，定量限為０．１μｇ／１０ｇ。

第三法 微生物法

１６原理

維生素Ｂ１２是萊士曼氏乳酸桿菌生長所必需的營養(yǎng)素。在一定條件下，萊士曼氏乳酸桿菌的生長

與維生素Ｂ１２的含量成對應關系。根據(jù)維生素Ｂ１２的含量與透光率（或吸光度值）的標準工作曲線，計算出試樣中維生素Ｂ１２的含量。

８

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１７試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６８２規(guī)定的二級水。

１７．１試劑

１７．１．１氯化鈉（ＮａＣｌ）。

１７．１．２無水磷酸氫二鈉（Ｎａ２ＨＰＯ４）。１７．１．３無水偏重亞硫酸鈉（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）。１７．１．４一水合檸檬酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７·Ｈ２Ｏ）。１７．１．５氫氧化鈉（ＮａＯＨ）。

１７．１．６鹽酸（ＨＣｌ）。

１７．１．７乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。

１７．２菌株

萊士曼氏乳酸桿菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犾犲犻犮犺犿犪狀犻）ＡＴＣＣ７８３０或等效菌株。

１７．３標準品

維生素Ｂ１２（氰鈷胺素）標準品（Ｃ６３Ｈ８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ，ＣＡＳ號：６８１９９）：純度≥９％，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準品。

１７．４試劑配制

１７．４．１乙醇溶液（２５％）：量?。玻担埃恚桃掖迹铀♂屩粒保埃埃恚?，混勻。

１７．４．２氯化鈉溶液（９ｇ／Ｌ）：稱?。梗埃缏然c溶于１００ｍＬ水中，分裝于具塞試管中，每管１０ｍＬ，

１２１℃滅菌１５ｍｉｎ。

１７．４．３鹽酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：量?。梗埃恚帖}酸，加水稀釋至１００ｍＬ，混勻。

１７．４．４氫氧化鈉溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：稱取４０ｇ氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至１００ｍＬ，混勻。

１７．４．５提取溶液：稱取無水磷酸氫二鈉１．３ｇ，無水偏重亞硫酸鈉１．０ｇ，一水合檸檬酸１．２ｇ，用１０ｍＬ

水溶解。

１７．５標準溶液配制

１７．５．１維生素Ｂ１２標準儲備液（１０μｇ／ｍＬ）：稱?。保埃恚纾ň_至０．０１ｍｇ）維生素Ｂ１２標準品于５０ｍＬ燒杯中，用乙醇溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至１００ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，搖勻。轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，于－２０℃下避光保存，有效期３個月。

１７．５．２維生素Ｂ１２中間液（１０ｎｇ／ｍＬ）：準確吸取１．０ｍＬ維生素Ｂ１２標準儲備液，置于１０ｍＬ容量

瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，搖勻。轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，于４℃下避光保存，有效期３個月。１７．５．３維生素Ｂ１２標準工作液（１ｎｇ／ｍＬ）：準確吸?。保埃恚叹S生素Ｂ１２標準中間液，置于１０ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。臨用現(xiàn)配。

１７．５．４維生素Ｂ１２標準使用工作液：分別吸?。担恚叹S生素Ｂ１２標準工作液置于２５０ｍＬ和５０ｍＬ容

量瓶中，用水定容至刻度。高濃度溶液的濃度為０．０２ｎｇ／ｍＬ；低濃度溶液的濃度為０．０１ｎｇ／ｍＬ。臨用現(xiàn)配。

１７．６培養(yǎng)基

１７．６．１乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：配制方法見Ｄ．１。

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１７．６．２乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：配制方法見Ｄ．２。

１７．６．３維生素Ｂ１２測定用培養(yǎng)基：配制方法見Ｄ．３。

注：商品化的合成培養(yǎng)基，按照說明書操作。

１７．７材料

１７．７．１無菌吸管：１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器和吸頭。

１７．７．２瓶口分液器：０ｍＬ～１０ｍＬ。

１７．７．３錐形瓶：２０ｍＬ。

１７．７．４容量瓶（Ａ類）：１０ｍＬ、２５０ｍＬ、５０ｍＬ。

１７．７．５單刻度吸管（Ａ類）：５ｍＬ。１７．７．６漏斗：直徑９０ｍｍ。１７．７．７定量濾紙：直徑９０ｍｍ。１７．７．８試管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ。１７．７．９玻璃珠：直徑約５ｍｍ。

注：準備玻璃器具時，使用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可）對硬質(zhì)玻璃測定管及其他必

要的玻璃器皿進行清洗，清洗之后的玻璃器具于２０℃干燥２ｈ。

１８儀器設備

１８．１天平：感量為０．０１ｇ、０．０１ｇ和０．０００１ｇ。

１８．２ｐＨ計：精度０．０１。

１８．３分光光度計。

１８．４恒溫培養(yǎng)箱：３６℃±１℃。

１８．５振蕩培養(yǎng)箱：３６℃±１℃，振蕩速度１４０ｒ／ｍｉｎ～１６０ｒ／ｍｉｎ。

１８．６壓力滅菌器：１２１℃（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）；１２５℃（０．１３ＭＰａ～０．１５ＭＰａ）。

１８．７恒溫儀（或水浴鍋）：１０℃±１℃。１８．８離心機：轉(zhuǎn)速≥２００ｒ／ｍｉｎ。１８．９冰箱：２℃～８℃。

１８．１０渦旋振蕩器。

１８．１ 均質(zhì)器。

１９試驗步驟

１９．１測試菌液的制備

１９．１．１菌株復蘇：將萊士曼氏乳酸桿菌（ＡＴＣＣ７８３０）的凍干菌株活化后，接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，３６℃±１℃培養(yǎng)１８ｈ～２４ｈ。再轉(zhuǎn)種２代～３代來增強活力。置２℃～８℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ浚保担滢D(zhuǎn)種一次，傳代次數(shù)不能超過１５次。

１９．１．２菌懸液制備：將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，３６℃±１℃培養(yǎng)１８ｈ～２４ｈ，以

２００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，棄去上清液，加入１０ｍＬ９ｇ／Ｌ氯化鈉溶液，混勻，再離心２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，如前操作，棄去上清液，再加１０ｍＬ９ｇ／Ｌ氯化鈉溶液，混勻。

１９．１．３測試菌液：吸適量菌懸液于１０ｍＬ９ｇ／Ｌ氯化鈉溶液中，混勻制成測試菌液。用分光光度計，

以９ｇ／Ｌ氯化鈉溶液做空白，于５０ｎｍ波長下檢測測試菌液的透光率，使測試菌液透光率在６０％

～８０％。

１０

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１９．２樣品前處理

１９．２．１試樣制備

固體樣品粉碎、研磨，均質(zhì)混勻。液體樣品試驗前振搖混勻。所有制備后的試樣冷藏保存，一周內(nèi)測定。

１９．２．２試樣提取

稱一定量的樣品（精確至０．００１ｇ，樣品中含維生素Ｂ１２為５０ｎｇ～１０ｎｇ）于２５０ｍＬ高壓滅菌瓶中，用１０ｍＬ的提取溶液混勻后，加１５０ｍＬ水，搖勻，置于壓力滅菌器中１２１℃水解１０ｍｉｎ，冷卻后用鹽酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）調(diào)ｐＨ至４．５±０．２，轉(zhuǎn)入２５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度。混勻，過濾。移取濾液５ｍＬ，加入２０ｍＬ～３０ｍＬ水，用氫氧化鈉溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）調(diào)ｐＨ至６．８±０．２，轉(zhuǎn)入１０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，作為試樣提取液。

必要時進一步調(diào)整稀釋倍數(shù)（用犳表示），使試樣提取液中維生素Ｂ１２的質(zhì)量濃度在０．０１ｎｇ／ｍＬ～

０．０２ｎｇ／ｍＬ，偏重亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度小于０．０３ｍｇ／ｍＬ。

１９．３標準曲線的配制

按表３分別加入維生素Ｂ１２標準使用工作液和維生素Ｂ１２測定用培養(yǎng)基于試管中，一式三份。

表３標準曲線的配制

試管號

Ｓ１

Ｓ２

Ｓ３

Ｓ４

Ｓ５

Ｓ６

Ｓ７

Ｓ８

Ｓ９

Ｓ１０

水／ｍＬ

５

５

４

３

２

１

０

２

１

０

０．０１ｎｇ／ｍＬ標準使用工作液／ｍＬ

０

０

１

２

３

４

５

０

０

０

０．０２ｎｇ／ｍＬ標準使用工作液／ｍＬ

０

０

０

０

０

０

０

３

４

５

測定用培養(yǎng)基／ｍＬ

５

５

５

５

５

５

５

５

５

５

１９．４待測液的配制

按表４分別加入水、試樣提取液和維生素Ｂ１２測定用培養(yǎng)基于試管中，一式三份。

表４待測液的配制

試管號

１

２

３

４

水／ｍＬ

４

３

２

１

試樣提取液／ｍＬ

１

２

３

４

測定用培養(yǎng)基／ｍＬ

５

５

５

５

１９．５滅菌

在１９．３和１９．４中所有需培養(yǎng)的試管內(nèi)分別加入一粒玻璃珠，蓋上試管帽，１２１℃滅菌５ｍｉｎ（商品培養(yǎng)基按標簽說明進行滅菌）。

１９．６接種

將滅菌后的試管迅速冷卻至３０℃以下。除標準曲線管中空白Ｓ１管外，用移液器分別向上述試管

１

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中加入１滴（約５０μＬ）測試菌液。

１９．７培養(yǎng)

將試管于３６℃±１℃培養(yǎng)１９ｈ～２０ｈ。培養(yǎng)結(jié)束后，對每支試管進行目測檢查，未接種試管Ｓ１內(nèi)培養(yǎng)液應是澄清的，如果Ｓ１管出現(xiàn)渾濁，則測定無效，需重做試驗。

１９．８測定

１９．８．１以接種空白管做對照，測定最高濃度標準曲線試管的透光率，２ｈ后重新測定。兩次結(jié)果透光率差值若小于２％，則取出全部檢驗管測其透光率。

１９．８．２用未接種空白試管（Ｓ１）作空白，將分光光度計透光率調(diào)到１０％（或吸光度為０），讀出接種空

白試管（Ｓ２）的讀數(shù)。再以接種空白試管（Ｓ２）為空白，調(diào)節(jié)透光率為１０％（或吸光度為０），依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度）。

１９．８．３用渦旋振蕩器充分混合每一支試管內(nèi)培養(yǎng)物（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進行測定，波長５０ｎｍ。待讀數(shù)穩(wěn)定３０ｓ后，讀出透光率，每支試管的穩(wěn)定時間要相同。各標準曲線濃度點３管吸光度值的相對標準偏差應小于１５％。如果３支試管吸光度的相對標準偏差大于或等于１５％，則舍去該標準曲線濃度點（舍去的標準曲線濃度點數(shù)量不得超過一個）。以標準系列管中維生素Ｂ１２濃度為橫坐標，透光率為縱坐標，繪制標準曲線。

１９．８．４根據(jù)待測液的透光率，從標準工作曲線中計算該待測液中維生素Ｂ１２的濃度，根據(jù)稀釋因子和

稱樣量計算出試樣中維生素Ｂ１２的含量。透光率超出標準曲線管Ｓ３～Ｓ１０范圍的測試值要舍去。１９．８．５用每支試管的透光率計算每毫升每個編號待測液中維生素Ｂ１２的濃度，并計算該編號待測液的維生素Ｂ１２濃度平均值，每支試管測得的濃度不得超過該平均值的１５％，超過者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個編號的待測液的總管數(shù)的２／３，用于計算試樣含量的數(shù)據(jù)是不充分的，需要重新檢驗。如果符合要求的管數(shù)超過原來管數(shù)的２／３，重新計算每一個編號的有效試樣管中每毫升測定液中維生素Ｂ１２含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值為ρ。用式（３）計算試樣中維生素Ｂ１２的含量犡。

注：繪制標準曲線，既可讀取透光率（犜％），也可讀取吸光度（犃）。

２０分析結(jié)果的表述

犡＝

試樣中維生素Ｂ１２（以氰鈷胺素計）的含量按式（３）計算：

式中：

ρ×犳×１０

犿×１００

……（３）

犡 ——樣品中維生素Ｂ１２的含量，單位為微克每百克（μｇ／１０ｇ）；

ρ ——有效試樣管中維生素Ｂ１２濃度的總平均值，單位為納克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；

犳 ——樣液稀釋倍數(shù)；

１０ ——換算系數(shù)；

犿 ——試樣的質(zhì)量，單位為克（ｇ）。

１００——換算系數(shù)。

結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

２１精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的１５％。

１２

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２ 其他

本方法檢出限為０．１μｇ／１０ｇ。

經(jīng)驗證比較確認后，可采用檢測體積等比例縮小的微生物微量培養(yǎng)法。

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犃．１柱容量驗證

附 錄犃

免疫親和柱參考驗證方法

準確吸?。矗?/p>