《動物基因工程》word版

1、PAGE PAGE 12第七章 動物基因工程世界第一只轉基因動物：轉入生長激素基因的小鼠世界首只轉基因靈長類動物安迪2001年月日，美國科學家宣布培育出了世界上首只轉基因猴“安迪”。 此項成果將為人類b0S9Hw F S0K&w最終戰(zhàn)勝糖尿病、乳腺癌、帕金森氏9MFq/nnIF:Z0i癥和艾滋病等頑癥提供幫助。-a1Y-D0p K東方糖尿病網(wǎng)8T&Oz.OLt 在“安迪”體內(nèi)的是一種綠色熒光蛋白（）標志基因。研究人員共對只猴子的卵母細胞進行了轉基因處理，接著對東方糖尿病網(wǎng)1bIX429Y F挑選出的個轉基因卵母細胞進行人工授精，然后把這個受精卵分別植入,Qe$zA)o只代孕猴媽媽的子宮中，結果

2、共有只猴媽媽懷孕。但其中有三只小猴不幸pXW&L KKT夭折，還有一只未獲成功，只有“安迪”不僅產(chǎn)下后身體健康，而且轉基因特征Xhw4Ht+*1明顯。東方糖尿病網(wǎng)u-PB;h/fv&n東方糖尿病網(wǎng)wkmg&sZ%)s轉入熒光蛋白基因的兔子和鼠2000年，法國科學家利用基因技術“制造”出了一只可以發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”。應用了受精卵顯微注射技術，從水母身上采集了熒光蛋白，基因改良后，使它的發(fā)光率比原先提高了兩倍，再將該基因植入到了兔子的受精卵中，由此培養(yǎng)出了會發(fā)光的兔子Alba。 第一節(jié) 動物基因轉移的選擇標記一、嘌呤和嘧啶的生物合成嘌呤核苷酸生物合成途徑從頭合成途徑5-磷酸核糖-1-焦

3、磷酸（PRPP） 次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP） AMP、GMP補救合成途徑：次黃嘌呤核苷（HR） 次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP） AMP、GMP嘧啶核苷酸生物合成途徑從頭合成途徑尿嘧啶核苷一磷酸（UMP） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）補救合成途徑胸腺嘧啶核苷（TR） 胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）二、胸腺激酶基因選擇系統(tǒng)選擇TK+細胞的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidne)，所以叫做HAT選擇法?；驹硎?，如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(APT)處理細胞， 二氫葉酸還原酶便被抑制，培養(yǎng)基中的還原輔助因子四氫葉酸因得不到補充而逐漸耗

4、盡，于是從dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻斷。但次黃嘌呤是dATP和dGTP補救合成途徑的一種底物，培養(yǎng)基中補加有此種物質時，細胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，繼續(xù)合成出這些脫氧嘌呤三磷酸(dATP和dGTP)。同時，由于在HAT培養(yǎng)基中補加有外源的胸苷，所以TK+細胞通過胸苷激酶的作用可把它合成為dTTP，繼續(xù)存活下去；而TK細胞則不會發(fā)生這種合成，因而死亡。 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細胞（tk -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸轉移酶（HPRT

5、）編碼基因缺陷的受體細胞（hprt -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因hprt與之遺傳互補哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記氨基糖苷磷酸轉移酶二氫葉酸還原酶潮霉素B磷酸轉移酶胸甘激酶基因黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶腺苷脫氨酶第二節(jié) 病毒載體實驗證明，一些真核生物的病毒，經(jīng)過改建之后，都可以發(fā)展成為用于轉移動物基因的分子載體。這主要是由于動物病毒具有如下的特點：動物病毒含有能夠被真核細胞識別的有效的啟動子。有許多種動物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復制，使其基因組拷貝數(shù)達到相當高的水平。有些動物病毒具有控制自己復制的順式元件和反式作

6、用因子。有些動物病毒，在它們的復制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。病毒的外殼蛋白質能夠識別細胞接受器。用病毒外殼蛋白質包裝重組質粒DNA形成的假病毒顆粒，即構成了一種高效的轉化體系。一、SV40病毒載體 猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40, SV40)是迄今為止研究得最為詳盡的乳多空病毒(Papova viruses)之一。SV40病毒的基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，其大小僅有5243bp，很適于基因操作。1.SV40病毒的基本生物學特性 SV40病毒是一種小型的20面體的蛋白質顆粒，由三種病毒外殼蛋白質Vp1、Vp2和Vp3構成，中間包裝著一條環(huán)

7、形的病毒基因組DNA。同其它病毒不同，SV40 DNA是同除了H1之外的所有寄主細胞組蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相結合。這些組蛋白使病毒DNA分子緊縮成真核染色質所特有的念珠狀核小體，這種結構特稱為微型染色體(minichromosome)。感染之后的SV40基因組，輸送到細胞核內(nèi)進行轉錄和復制。SV40病毒基因組表達的時間順序是相當嚴格的,據(jù)此可將其區(qū)分為早期表達區(qū)和晚期表達區(qū)。 圖2.SV40病毒載體野生型的SV40病毒顆粒的包裝范圍相當嚴格，超過其基因組大小(5.2kb)的重組DNA就不能夠被包裝為成熟的病毒顆粒。而且，SV40還存在著寄主細胞的局限性，它只能在受體細胞中增殖，并

8、最終導致寄主細胞的死亡，這樣就不能作長期的培養(yǎng)使用。因此，野生型的SV40病毒必須經(jīng)過改造之后，才能發(fā)展成為基因克隆的有用載體。目前設計的以SV40為基礎的基因克隆載體，主要有兩種不同的類型：取代型的重組病毒載體；重組的病毒-質粒載體（1）取代型的重組病毒載體。外源DNA是直接插入在缺陷性的病毒基因組上。由于插入的外源DNA片段，在大小上同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，因此形成的重組體DNA能夠在哺乳動物的受體細胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補充這段被取代的病毒基因組DNA的功能，必須使用一種與之互補的輔助病毒。晚期區(qū)段取代載體實驗中已經(jīng)觀察到，缺失了整個晚期區(qū)段功能的SV40病毒，同

9、可互補這段功能的一種溫度敏感(ts)的輔助病毒混合感染時，仍然能夠增殖。因此，可以通過取代晚期區(qū)段的途徑構建SV40病毒載體。最常用的輔助病毒是tsA突變體，它合成一種溫度敏感的T抗原。圖早期區(qū)段取代載體按照同樣的道理，也可以構建出早期區(qū)段取代載體。 當SV40病毒的早期區(qū)段被取代后，就失去了T抗原的功能，因此，早期區(qū)段取代載體必須使用具有互補功能的輔助病毒。這自然顯得比較麻煩。1981年Y.Gluzman發(fā)現(xiàn)了一種特殊的COS細胞系，能夠有效地互補T抗原，從而大大地方便了早期區(qū)段取代載體的使用，被認為是SV40載體發(fā)展歷程中的一個重要的突破。（2）重組的病毒-質粒載體第二種是重組的病毒-質粒

10、載體。在這類載體中，病毒基因組部分只保留下維持在哺乳動物細胞中進行復制所必須的有關序列，但它融合上了一個細菌質粒，因而還能夠在大腸桿菌細胞中進行復制和增殖。不過這種重組體分子沒有被包裝成病毒顆粒，不會出現(xiàn)裂解感染的情況，它實際上是一種類似于質粒的DNA分子載體。含有完整早期區(qū)段和復制起點的病毒-質粒載體SV40和多瘤病毒(polyoma virus)的基因組能夠在寄主細胞中快速地復制，并達到相當高的拷貝數(shù)。利用這種能力，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一類特殊的病毒載體。這類病毒載體，實質上是由病毒的早期區(qū)段和復制起點同大腸桿菌的質粒分子重組而成的，所以又叫做病毒-質粒載體(viral-plasmid vec

11、tor)。由于它們既可在大腸桿菌細胞中復制，也能在哺乳動物細胞中復制，根據(jù)這種特性，在有的文獻中有時也稱之為穿梭載體。圖：病毒-質粒載體pC10就是一種典型的穿梭載體，其中的早期區(qū)段和復制起點來自多瘤病毒，質粒是大腸桿菌的pBR322，克隆的外源DNA是小鼠免疫珠蛋白重鏈基因。微型病毒復制子-質粒載體實驗發(fā)現(xiàn)，在COS或HFS細胞中，含有SV40 DNA復制起點的任何大小的環(huán)形DNA，都能夠像質粒一樣進行獨立的復制。根據(jù)這種原理，許多實驗室都把只含有SV40復制起點的DNA片段，即所謂的微型病毒復制子(mini-viral replicon)，插入在大腸桿菌的質粒載體上，構成了一種新型的病毒-

12、質粒載體，稱為微型病毒復制子-質粒載體。圖：pTBC-1就是一種典型的 SV40微型病毒復制子-質粒載體，如果將這種載體導入COS或HFS細胞，它們就能利用細胞提供的T抗原復制出非常大量的拷貝數(shù)。所以可以用來高水平地表達外源蛋白質。 二、反轉錄病毒載體 反轉錄病毒(retroviruses)是一類含單鏈RNA的動物病毒。它的基因組含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。迄今已經(jīng)在鳥類及哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)了許多種反轉錄病毒，例如鳥類的脾壞死病毒(SNV)、鼠類的乳腺腫瘤病毒(MMTV)等等，但其中研究得最為詳盡的則要數(shù)勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)。RSV

13、病毒感染了雞之后，就會誘發(fā)產(chǎn)生腫瘤。從感染細胞中分離出來的反轉錄病毒的DNA，是一種有用的動物細胞的基因載體。反轉錄病毒具有許多優(yōu)點，便于發(fā)展作為動物基因克隆載體。第一，在大多數(shù)情況下，反轉錄病毒的腫瘤基因(oncogene，onc)都能夠在正常的細胞中轉錄。第二，反轉錄病毒的寄主范圍相當廣泛，包括無脊椎動物和脊椎動物。第三，反轉錄病毒具有強啟動子，克隆此類載體上的外源基因有可能得到有效的表達。第四，反轉錄病毒不但感染效率高，而且通常還不會招致寄主細胞的死亡，被它感染的或轉化的動物細胞能夠持續(xù)許多世代，保持正常生長和形成感染性病毒顆粒的能力。1.反轉錄病毒的生命周期一種典型的反轉錄病毒的生命周

14、期，是從它的感染顆粒同寄主細胞表面待定的接受器結合，并進入細胞的時候開始的。整個周期可以分為兩個時期。在第一時期，首先是在細胞質中的病毒顆粒脫掉蛋白質外殼，釋放出的()RNA在反轉錄酶作用下，合成()DNA。 ()RNA鏈通過反轉錄酶加工作用，被逐漸地降解掉。剩下的()DNA繼續(xù)指導反轉錄酶合成()DNA。最終形成的雙鏈形式的DNA分子整合到寄主細胞的染色體基因組上，成為原病毒(provirus)。在雙鏈形式的DNA進入寄主細胞核成為原病毒之后，便開始了反轉錄病毒生命周期的第二時相。此時，原病毒DNA進行活躍的轉錄，合成出來的轉錄本被加工成mRNA，進而轉譯為2種成品蛋白質(finished

15、proteins)和2種聚合蛋白質(polyproteins)。病毒顆粒是在細胞質中組裝的，成熟后即通過出芽(budding)的形式從感染細胞中擠壓出去，而細胞本身并沒有任何損傷，因此可以長時間持續(xù)地釋放病毒顆粒。圖：反轉錄病毒的生命周期2.反轉錄病毒載體 (1)輔助病毒互補的反轉錄病毒質粒載體(2)不需要輔助病毒互補的反轉錄病毒質粒載(3)廣寄主的反轉錄病毒載體(4)反轉錄病毒表達載體 三、痘苗病毒載體 痘苗病毒(Vaccinia virus)具有雙鏈DNA基因組，同天花的病原體天花病毒(Variola virus)的親緣關系十分密切。當人們接種了痘苗病毒之后，便可獲得對天花的高度免疫性。在

16、DNA重組技術發(fā)展之后不久，就有人將外源DNA片段插入到痘苗病毒的基因組中，得到了具有生物活性的重組病毒。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，基因工程學家便設想構建能夠表達多種病原體抗原的重組痘苗病毒，作為預防這些病原體感染的活疫苗。(1)痘苗病毒的特性 痘苗病毒是在細胞質中進行復制和轉錄的的，因此自身需要編碼為這些表達活性所需要的全部蛋白酶。由于痘苗病毒擁有廣泛的寄主范圍，而且其基因組至少能夠容納25kb大小的外源DNA片段的插入，具有相當大的克隆能力。這些優(yōu)點，又使痘苗病毒具備了發(fā)展作為動物基因克隆載體的良好的條件。然而由于痘苗病毒基因組DNA是非感染性的，故不能直接用于感染寄主細胞。(2)痘苗病毒載體的構建痘

17、苗病毒載體pGS20為例，首先將編碼著tk基因的痘苗病毒基因組DNA之Hind III-J片段，克隆到大腸桿菌質粒載體pBR328分子上；然后再把含有另一種痘苗病毒基因的啟動子(p7.5)和轉錄起點的275bpDNA區(qū)段，插入到tk基因序列中間，于是便構成了痘苗病毒質粒載體pGS20應用pGS20痘苗病毒質粒載體，已成功地在猿猴細胞中表達乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg，和流感病毒血細胞凝集素(IHA)等多種蛋白質。疫苗病毒載體pGS20圖四、乳頭瘤病毒載體 乳頭瘤病毒(Papilloma viruses)能夠感染包括人類在內(nèi)的多種脊椎動物，產(chǎn)生上皮腫瘤。但是只有完全分化的扁平的上皮細胞(epi

18、telial cell)，才能產(chǎn)生感染性的乳頭瘤病毒，迄今為止還沒有辦法在培養(yǎng)的細胞中增殖這種病毒。 它能以多拷貝的染色體外雙鏈DNA形式在哺乳動物細胞中培養(yǎng)維持很多代。構建穿梭載體策略：一、將編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因刪除。二、將剩下的病毒基因組克隆到大腸桿菌質粒中，就夠建成了穿梭載體。它在大腸桿菌中以質粒形式存在，而在人類細胞中以既不能整合到宿主DNA中，又不能產(chǎn)生病毒粒子裂解宿主的染色體外DNA形式存在五、腺病毒載體 腺病毒（adenovirus）屬腺病毒科，腺病毒科分為兩個屬，哺乳動物腺病毒屬和禽腺病毒屬。腺病毒是一類無囊膜的20面體病毒，直徑70-90納米，其中20面體的每個頂

19、角有一條纖維突起。由于人腺病毒具有易感性、宿主范圍廣、毒性低、使用安全、可容納大的外源DNA片段，以及外源DNA片段不會整合到宿主染色體上等特性，因此人的腺病毒克隆載體成為基因轉移中最有前途的克隆載體之一。腺病毒載體的構建首先：構建一個含有部分腺病毒基因組的質粒（ ），在其中的腺病毒基因中插入外源基因或用外源基因取代其中的一個片斷；另外，構建一個含有腺病毒基因組其它部分的質粒（）；兩個質粒的腺病毒基因組有部分重合，這兩種質粒都可以在大腸桿菌中擴增，然后共轉染宿主細胞，兩種質粒中腺病毒基因組部分重合處發(fā)生同源重組，形成完整的病毒基因組。第三節(jié) 外源DNA導入動物細胞的方法 哺乳動物細胞很難捕獲和

20、表達外源的DNA。下面是六種病毒載體以外的最常用最有效的用于哺乳動物基因轉移的技術手段。包括如下：(i)磷酸鈣轉染技術；(ii)DEAE-葡聚糖轉染技術；(iii)顯微注射技術；(iv) 電穿孔技術；(v)原生質體融合技術。 一、磷酸鈣轉染技術 磷酸鈣轉染的基本步驟將待轉染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液；在不斷攪拌過程中，逐滴緩緩地加入到Hepes-磷酸鈣溶液中去，形成一種磷酸鈣-DNA共沉淀； 然后用吸管仔細轉移共沉淀物，使之粘附到培養(yǎng)的哺乳動物單層細胞表面，就會迅速地被細胞所捕獲。保溫幾小時后，將細胞洗凈，并更換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至最終實現(xiàn)外源DNA的高水平表達

21、。 圖二 .DEAE-葡聚糖轉染技術 二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，簡稱DEAE-葡聚糖，是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞捕獲外源的DNA，實現(xiàn)瞬時的有效表達(1)DEAE-葡聚糖轉染的一般程序DEAE-葡聚糖轉染主要有兩種不同的方式。一種方式是先使病毒的DNA直接同DEAE-葡聚糖混合，形成了DNA/DEAE葡聚糖復合物后，再用來處理受體細胞；另一種是受體細胞先用DEAE-葡聚糖溶液作預處理，然后再用來與轉染的DNA接觸。在這兩種轉染方式中，受體細胞在用DNA或DNA/DEAE葡聚糖復合物處理前，都要先用等滲溶液漂洗，除去培養(yǎng)液中

22、的血清成分。(2)DEAE-葡聚糖轉染的可能機理及影響因素關于DEAE-葡聚糖促使哺乳動物細胞捕獲外源DNA的分子機理，一種認為DEAE-葡聚糖同DNA結合成復合物，可以保護DNA免受核酸酶的降解作用；另一種則認為DEAE-葡聚糖可以同細胞膜發(fā)生作用，從而使DNA能夠容易地穿過細胞表面而進入細胞內(nèi)部。影響DEAE-葡聚糖的轉染效率的主要因素：細胞的數(shù)量、DNA的濃度和DEAE-葡聚糖的濃度最為重要。大體說來，按每個直徑10cm的培養(yǎng)皿中加入 110ug的轉染DNA，并使用每毫升培養(yǎng)基含100400ug DEAE-葡聚糖的溶液，對于絕大多數(shù)類型的細胞，都能得到很好的轉染效率。由于DEAE-葡聚糖

23、對有些細胞具有毒性，因此用低濃度溶液作短時間的接觸反應可能較為合適。三.基因顯微注射技術 應用玻璃顯微注射器，可以把重組DNA直接注射到哺乳動物細胞的細胞質或細胞核。通常根據(jù)DNA注射的不同方式，可以把顯微注射分為：（1）真正的顯微注射(true microinjection)法，DNA是由注射針直接注入細胞。（2）“穿刺”(pricking)導入法，DNA是處在細胞周圍培養(yǎng)基中，它通過穿刺形成的小孔進入細胞的內(nèi)部，或是隨穿刺的針頭一道進入的。用顯微注射法轉移基因的效率明顯地超出其它方法。顯微注射用的受體細胞，多數(shù)是沿培養(yǎng)皿貼壁生長的單層細胞。四、電穿孔DNA轉移技術電穿孔(electropo

24、ration)是指在高壓電脈沖的作用下使細胞膜上出現(xiàn)微小的孔洞。從而導致不同細胞之間的原生質膜發(fā)生融合作用的細胞生物學過程。幾乎所有類型的細胞，包括植物的原生質體、動物的初生細胞，以及不能用其它方法(諸如磷酸鈣或DEAE-葡聚糖法)轉染的細胞，都可以成功地使用電穿孔技術進行基因轉移。此項技術具有操作簡便，基因轉移效率高等優(yōu)點。1）基本原理在高壓電場的作用下，細胞膜因發(fā)生臨時性破裂所形成的微孔，足以使大分子以及像ATP這樣的小分子從外界進入細胞內(nèi)部，或是反向流出細胞。細胞膜上微孔的關閉是一種天然衰減的過程，在0下，這種過程會被延緩進行。在微孔開啟期間，細胞外環(huán)境中的核酸分子便會穿孔而入，并最終進

25、到細胞核內(nèi)部。具有游離末端的線性DNA分子，易于發(fā)生重組，因而更容易整合到寄主染色體，形成永久性的轉化子。超盤旋的DNA比較容易被包裝進染色質，因此一般說來它對于瞬時基因表達的實驗更為有效。（2）操作程序將盛有細胞和 DNA混合液的特制小容器置于電泳沖儀的正負電極間，在 0 下加高壓(2.04.0kV)電脈沖 10分鐘后，將處理的細胞轉移到新鮮培養(yǎng)基生長 2天，再行篩選。電穿孔之前若用秋水仙酞胺預處理細胞10小時，可提高轉化效率310倍。 (3)影響因素 脈沖的最大電壓和脈沖持續(xù)的時間，是影響電穿孔轉染效率的兩個主要因素，而與DNA濃度則無多大關系。電穿孔轉染效率主要取決于所用的細胞類型。對于

26、不適合用傳統(tǒng)方法轉染的細胞，用電穿孔法得到的永久轉化的頻率約為10-410-5之間。五、脂質體載體法脂質體(liposomes)是一種人造的脂質小泡(lipid vesicles)，外周是脂雙層，內(nèi)部是水腔。用它作載體可以把外源DNA導入培養(yǎng)的哺乳動物細胞。這種由脂質體介導的使外源DNA導入細胞的方法，叫做脂質體載體法，又叫做脂質轉染法(lipofection)。脂質體結構圖接(1)脂質體的制備制備脂質體的方法主要有如下兩種。頭一種是將適宜的脂質懸浮在液體介質中，然后迅速地振蕩，使之形成大小相當一致的脂質體；另一種是用小型的注射針頭，將脂質注射到酒精水溶液中，并快速混勻。(2)脂質轉染法第一種

27、常用的脂質轉染法是，將外源DNA與陽離子型的脂質體混合形成DNA-脂質復合物。這種復合物可有效地被受體細胞捕獲，實現(xiàn)基因的高頻率轉移，故這種方法又叫做DNA-脂質復合物轉染法。在這個過程中，DNA并不是被包裝在脂質體的內(nèi)部，而是通過兩者之間的靜電引力作用結合在一起的。第二種常用的脂質轉染法叫做脂質體載體法。它是將外源DNA包裝在脂質體的內(nèi)部，然后通過脂質體的雙層膜同受體細胞膜之間的融合作用，使外源DNA進入細胞質，爾后再進入細胞脂質體載體法轉移基因的基本步驟(3)脂質體載體法的優(yōu)越性制備程序比較簡單，用它包裝的 DNA在4下可長期保存不失活性，以及毒性低、包裝容量大、可保護DNA免受核酸酶的降解作用等等。除此之外，脂質體法可以用來將外源的蛋白質導入受體細胞，為在活細胞內(nèi)研究蛋白質的功能提供有用的途徑。 七 .哺乳動物細胞基因打靶 基因打靶(gene targeting)技術，通過在轉染細胞中發(fā)生的外源打靶基因與核基因組目標基因之間的DNA同源重組(homologous recombination)，能夠使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上，從而達到改變細胞遺傳特性的目的?；虼虬械姆肿踊A是，兩條具有同樣或類似核苷酸序列的同源DNA分子之間發(fā)生的遺傳信息的重組事件。這也就是說，基因打靶的一個基本條件是，在外源打靶