環(huán)磷酰胺對小鼠免疫抑制的動物模型建立及其免疫功能的測定

1、環(huán)磷酰胺對小鼠免疫抑制的動物模型建立摘要:目的建立環(huán)磷酰胺對小鼠的免疫抑制的動物模型，從天然免疫功能和獲得免疫 功能兩方面檢測對小鼠的影響。方法初次免疫設(shè)立實驗組給予OVA-AL（OH）3（0.5/只） 和對照組給予NS（ 0.5/只）；8d,10d,12d,14d分別給實驗組和對照組注射 NS和 CTX（100mg/kg）;與 15d 加強(qiáng)免疫分別注射 NS 和 OVA-AL（OH）3（0.5/只）；22d 檢測免 疫功能結(jié)果與NS-NS組相比，CTX-NS組的SI值，雙向免疫及ELISA的效價無明顯 差別，但吞噬細(xì)胞指數(shù)及吞噬細(xì)胞百分率明顯降低；與NS-OVA相比CTX-OVA組的SI 明

2、顯降低，雙向免疫劑ELISA效價都降低結(jié)論環(huán)磷酰胺對小鼠的T淋巴細(xì)胞，B淋巴 細(xì)胞以及吞噬細(xì)胞有抑制作用Abstract：aims To establish animal model of cyclophosphamide in mice immunosuppression , test in mice from two aspects of natural immune function and immunity function methods Primary immune to set up the experimental group given OVA-AL（OH）3 and The

3、 control group given NS ; the 8th,10th,12th,14th day give the experimental group NS and the control group CTX ,and the 15th strengthen the immune;the 22th test the immune function results Compared with NS - NS group, the SI value of CTX - NS group, bidirectional immune potency and ELISA has no obvio

4、us difference, but the phagocyte index and phagocytes percentage decreased obviously; Compared with NS - OVA CTX - SI of OVA group was obviously lower, bidirectional immune agent ELISA titer were reduced conclusion Cyclophosphamide in mice of T lymphocyte, B lymphocyte and phagocytes have inhibition

5、關(guān)鍵詞：環(huán)磷酰胺CTX免疫抑制動物模型淋巴細(xì)胞建立一種環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型，并將其與正常小鼠進(jìn)行對照，通過檢測小鼠的 天然及獲得免疫功能對比其改變與不同，從而可知環(huán)磷酰胺對免疫抑制的作用，有利 于進(jìn)一步進(jìn)行對臨床應(yīng)用抗腫瘤的研究。1.材料與方法1.1材料1.11實驗動物：ICR小鼠4只，雌性，2022g，清潔級，吉林大學(xué)實驗動物中心。1.12重要器材：顯微鏡，離心機(jī)，超凈臺，細(xì)胞計數(shù)板，細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，打孔 器，加樣器（200p l,20p l），酶標(biāo)板，EP管1.13實驗試劑：CTXN西普德藥業(yè)公司），生理鹽水（NS），OVA+AL（OH）3，苦味酸, 培養(yǎng)液（IMDM）5%FCS,

6、ConA（10四/ml）,MTT（5四/ml）,白細(xì)胞計數(shù)液（2%冰醋酸）， 二甲亞砜（DMSO）,1.5%瓊脂，PBS，洗液（PBS-Tween20），封閉液 BSA（0.5%1%的牛血清白蛋白），酶標(biāo)抗體（HRP-GaM ），顯色底物，終止液，3%雞紅 細(xì)胞懸浮液，3%淀粉溶液，Giemsa-wrights染液1.2方法1.21小鼠模型的建立：初次免疫設(shè)立實驗組給予OVA-AL（OH）3（0.5/只）和對照組給予 NS（ 0.5/只）；8d,10d,12d,14d分別給實驗組和對照組注射NS和CTX（100mg/kg）;與 15d加強(qiáng)免疫分別注射NS和OVA-AL（OH）3（0.5/只）；

7、22d檢測免疫功能T淋巴細(xì)胞功能檢測（MTT法）實驗動物摘眼球取血后無菌操作取脾臟和胸腺，制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至1x107/ml,培養(yǎng)48小時，加入 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)2小時，小心吸取上清，加入DMSO震蕩是顆粒溶解，用酶標(biāo)儀測定 吸光度值A(chǔ)570nm，結(jié)果測量：用酶標(biāo)儀測定光密度值A(chǔ)570nm （用空白孔調(diào)零）， 記錄結(jié)果。結(jié)果判定：SI（刺激指數(shù)）=Con A刺激孔A值/對照組A值B淋巴細(xì)胞功能檢測雙向免疫擴(kuò)散法：實驗動物摘眼球取血，分離血清。制備瓊脂糖凝膠后進(jìn)行鋪膠，待 瓊脂糖凝固后與載玻片上打梅花孔。將血清倍比稀釋，稀釋度為1:2,1:4,1:8,1:16 .與 梅花

8、孔中央加入Ag（ OVA 0.1mg/ml），周圍的孔依次按順序加入生理鹽水，1:1， 1:2,1:4,1:8,1:16待測血清，放入濕盒，37 0C擴(kuò)散24小時后記錄結(jié)果。ELISA法：包被：用0.05M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原（OVA，10四/ml）稀釋。 100 W/well加入聚苯乙烯酶標(biāo)板中，4C過夜。封閉：棄孔內(nèi)溶液。加入150 W/well 洗液，43 C 60mins。加樣：棄封閉液，加倍比稀釋的待測免疫血清100叫孔，43C 孵育40mins，孵育結(jié)束后，用PBS-T 3min/次。酶抗：酶標(biāo)抗體，100l/well ,置43C 孵育40mins，用PBS-T 3m

9、in/次。 顯色：于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的底物溶液 100|d/well，室溫下避光顯色。終止：加50 W/well 2M硫酸（終止液）。結(jié)果判定： 肉眼觀察：與陰性對照孔相比有明顯呈色反應(yīng)的為陽性孔，相對應(yīng)的抗體的最高稀釋 度為該抗體的效價。酶標(biāo)儀測量：490nm濾光片下測光吸收值（A ）,與陰性對照孔A 值相比其比值22 ,相對應(yīng)的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。1.24吞噬細(xì)胞功能測定 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞試驗：實驗前2天，給小鼠腹腔 注射3%淀粉溶液。給小鼠腹腔注射3%雞紅細(xì)胞懸液0.5ml，-小時后想腹腔打2ml 生理鹽水，反復(fù)吹打后吸取腹腔液。取20p l加到玻璃板上，加Gie

10、msa-wrights染液 20p l靜置2分鐘蓋上蓋玻片顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：用40倍鏡查找觀察200個巨 噬細(xì)胞，計數(shù)其中未吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)、吞噬了雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)及被 吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù),計算吞噬百分率及吞噬指數(shù)。吞噬百分率=有吞噬作用的巨噬細(xì)胞數(shù)/計 數(shù)的總巨噬細(xì)胞數(shù)（200 ）x 100 % 吞噬指數(shù)=有吞噬作用的巨噬細(xì)胞吞入的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計數(shù)的總巨噬細(xì)胞數(shù)（200 ） 2結(jié)果2.1淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果:對照ConASI對照ConASINS-NS0.5830.7211.2370.2340.2501.068NS-OVA0.2390.2861.1970.3470.9262.

11、669CTX-NS0.7910.8101.0240.1820.2041.121CTX-OVA0.2620.2360.9010.0410.0411.000CTX-NS與NS-NS組的刺激指數(shù)對比有增高和降低兩種結(jié)果，結(jié)果出現(xiàn)誤差。CTX- OVA與NS-OVA組對照組的刺激指數(shù)相對降低，可知CTX可抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖 及轉(zhuǎn)化的功能2.2雙向免疫擴(kuò)散法實驗結(jié)果：NS-NS,CTX-NS,NS-OVA,CTX-OVA分別為 00 1:8 0除了 NS-OVA的效價結(jié)果為1 ： 8外其余均顯示為陰性，可知CTX可降低小鼠免B淋 巴細(xì)胞功能2.3 ELISA法實驗結(jié)果：NS-NS,CTX-NS,NS

12、-OVA,CTX-OVA 分別為 001:4096001:1280NS-NS組和CTX-NS組結(jié)果均為0，無特異抗原。與NS-OVA相比CTX-OVA的效價低, 說明CTX有明顯降低小鼠B淋巴細(xì)胞功能的作用2.4吞噬細(xì)胞功能測定結(jié)果:NS-NSCTX-NSNS-OVACTX-OVA總巨噬細(xì)胞數(shù)200200200200未吞噬巨噬細(xì)胞數(shù)138184150154吞噬的巨噬細(xì)胞數(shù)62165046吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)997783118吞噬百分率31%8%25%23%吞噬指數(shù)0.4950.3850.4150.590與NS-OVA相比CTX-OVA組的吞噬指數(shù)增高，吞噬百分率升高，與前面的結(jié)果相較， 得出NS-

13、OVA組的實驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)明顯錯誤，舍之。而與NS-NS組相比CTX-NS組的吞 噬指數(shù)降低，吞噬百分比明顯降低，可得，CTX有明顯降低小鼠吞噬細(xì)胞吞噬功能的 作用3.討論鑒于實驗數(shù)據(jù)的局限性以及實驗操作過程中的失誤以及實驗結(jié)果的誤差，對本次實驗 結(jié)果進(jìn)行如下分析：OVA與NS-OVA組對照組的刺激指數(shù)相對降低，可知CTX可抑制 小鼠T淋巴細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化的功能；雙向免疫NS-NS,CTX-NS,CTX-OVA效價為0，NS- OVA 效價為陽性1 ： 8.尤與實驗組CTX-OVA相比可知環(huán)磷酰胺對小鼠B淋巴細(xì)胞免疫 有抑制作用；ELISA實驗NS-OVA的效價比CTX-OVA明顯增大，可知環(huán)磷酰胺對小鼠 B淋巴細(xì)胞免疫抑制作用很強(qiáng)；吞噬細(xì)胞功能測定實驗中，NS-OVA小組的實驗結(jié)果由 于操作過程中出現(xiàn)了過錯，結(jié)果明顯有不正確之處，舍去不允與考慮，而NS-NS組與 CTX-NS組數(shù)據(jù)相比CTX-NS組的吞噬百分率明顯降低，吞噬指數(shù)也降低，說明，CTX 對在沒有抗原影響的情況下對小鼠的吞噬細(xì)胞吞噬功能仍有抑制作用。參考文獻(xiàn)：高苴，錢嘉林，劉長喜，嚴(yán)衛(wèi)星環(huán)磷酰胺對小鼠免疫抑制的動物模型建立 北京 環(huán) 境與職業(yè)醫(yī)學(xué)2004年8月第21卷第4期唐超明，李漢賢環(huán)磷酰胺