微生物遺傳與變異原理及方法

1、微生物遺傳與變異原理及方法 通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，要求掌握：1、細(xì)菌基因重組的原理和方法。2、真菌基因重組的原理和方法。3、微生物誘變育種的原理和方法。重點(diǎn)：細(xì)菌的基因重組難點(diǎn)：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，準(zhǔn)性生殖 微生物是理想的遺傳學(xué)研究材料：物種及代謝類型的多樣性；個(gè)體體制簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)體多為單倍體，基因組?。环敝晨?，易于累積不同的最終代謝產(chǎn)物及中間代謝物；菌落形態(tài)特征的可見性與多樣性；環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)體作用的直接和均勻；易變異、易得到營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株；一般都有相應(yīng)的噬菌體；存在著處于進(jìn)化進(jìn)程中的多種原始方式的有性生殖類等?；蚪Mgenome：一種生物的全套基因。表現(xiàn)型phenotype：生物可見

2、的或可測(cè)定的性狀遺傳型genotype：決定生物表現(xiàn)型的遺傳因子同樣遺傳型的生物在不同外界條件下，會(huì)顯現(xiàn)不同表現(xiàn)型，但遺傳型并非改變，這種變異為非遺傳性變異，只能稱適應(yīng)或飾變(modification)；只有遺傳型改變，從而引起表型變化才稱為變異，它發(fā)生在基因水平上，可以遺傳給子代。Serretia marcescens在25下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種深紅色的靈桿菌素，把菌落染成鮮紅色。可是，當(dāng)培養(yǎng)在37下時(shí)，群體中所有細(xì)胞都不產(chǎn)色素。如果重新降溫至25，產(chǎn)色素能力又得到恢復(fù)。第一節(jié) 生物遺傳信息的載體證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1928年，F(xiàn). Griffith；1944年O. T. Avery

3、 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。1952年，A. D. Hershy、M. Chase的噬菌體感染實(shí)驗(yàn)。1956年，H. Fraenkel-Conrat的TMV拆開和重建實(shí)驗(yàn)。Griffith的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)的闡明Hershey-Chase的噬菌體實(shí)驗(yàn)用35S和32P去分別標(biāo)記大腸桿菌，然后再用T2噬菌體感染，即可分別得到標(biāo)有35S和T2和32P的T2噬菌體。把標(biāo)記噬菌體與其宿主大腸桿菌混合，經(jīng)短時(shí)間(如10 min)保溫后，使T2完成吸附和侵入過(guò)程。在組織搗碎器中劇烈攪拌，以使吸附在菌體外表的T2蛋白外殼脫離細(xì)胞并均勻分布。進(jìn)行離心沉淀，再分

4、別測(cè)定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部的32P都和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中，而幾乎全部33S都在上清液中。這意味著噬菌體的蛋白外殼經(jīng)自然分離后仍留在細(xì)胞外部，只有核酸芯子才進(jìn)入宿主體內(nèi)；同時(shí)，由于最終能釋放出一群具有與親代同樣蛋白外殼的完整的子代噬菌體，說(shuō)明只有核酸才是其全部遺體信息的載體。后來(lái)通過(guò)電子顯微鏡的觀察也證實(shí)了這個(gè)論點(diǎn)。TMV重建實(shí)驗(yàn)遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式真核生物DNA分子與組蛋白結(jié)合構(gòu)成染色體，每條染色體有單一線性雙鏈DNA分子。一個(gè)真核生物細(xì)胞內(nèi)有多條染色體（脈孢菌7條，人23條）。高等生物中有2至多套染色體（動(dòng)物2倍，水稻4倍），真菌有雙倍體，但多數(shù)微生物是

5、單倍體。真核細(xì)胞核物質(zhì)外有核膜包圍，形成完整細(xì)胞核。原核生物DNA不與組蛋白結(jié)合，染色體僅由一條DNA組成，DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一條染色體（單倍體haploid）。無(wú)核膜膜包圍，只在細(xì)胞中央形成核區(qū)。質(zhì)粒plasmid原核生物中，除染色體以外，能夠自主復(fù)制的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子。它們攜帶少量遺傳基因，決定細(xì)胞的某些性狀，并非細(xì)菌生活必需。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)圖遺傳信息的傳遞和基因表達(dá)基因geneDNA分子的一定區(qū)段，攜帶特定的遺傳信息，是具有自主復(fù)制能力的遺傳功能單位。遺傳信息通過(guò)DNA連上的核苷酸排列順序表現(xiàn)出來(lái)。結(jié)構(gòu)基因決定多肽形成的堿基順序稱結(jié)構(gòu)基因，一個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)

6、后，產(chǎn)生一個(gè)多肽；即“一個(gè)基因一個(gè)酶”。調(diào)節(jié)基因?qū)Y(jié)構(gòu)基因起調(diào)節(jié)控制作用的稱調(diào)節(jié)基因。操縱子學(xué)說(shuō)基因的表達(dá)以DNA為模板，通過(guò)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA，然后將mRNA包含的堿基順序在核糖體中翻譯成相應(yīng)氨基酸序列的多肽。轉(zhuǎn)錄（transcription）雙鏈DNA單鏈，以其中一條為模板互補(bǔ)mRNA翻譯(translation)mRNA 多肽第二節(jié) 原核微生物的基因重組克隆clone不經(jīng)過(guò)有性細(xì)胞的結(jié)合，由體細(xì)胞發(fā)育成新個(gè)體，即無(wú)性繁殖?；蛑亟Mgene recombination兩個(gè)不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換，經(jīng)過(guò)基因的重新組合，形成新的基因型的過(guò)程。重組獲得的后代具有新的基因組合，表現(xiàn)出不同

7、于親本的新性狀。原核微生物沒有有性生殖，其基因重組通過(guò)轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)行。轉(zhuǎn)化Transformation 定義不經(jīng)其它媒介，來(lái)自供體（donor）的DNA片段或質(zhì)粒DNA直接進(jìn)入受體菌（recipient或receptor） ，并在受體中復(fù)制、表達(dá)的過(guò)程。轉(zhuǎn)化過(guò)程受體細(xì)胞呈現(xiàn)感受態(tài)，即容易接受外源DNA的生理狀態(tài)。外源DNA與感受態(tài)細(xì)胞結(jié)合并被吸收。外源DNA整合到受體菌中，成為受體菌染色體的一部分。轉(zhuǎn)染 transfection指用提純的病毒核酸去感染其宿主細(xì)胞或原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化示意圖轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction 定義通過(guò)完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，

8、把一個(gè)供體細(xì)胞的 DNA 片段轉(zhuǎn)移到另一個(gè)受體細(xì)胞中，并使后者發(fā)生遺傳變異的過(guò)程。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA 片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體或轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。 1952 年Zinder 和 Lederberg 在驗(yàn)證Salmonella typhimurium是否也存在接合現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。S. typhimurium：LT22A (trp-)； LT2(his-)LT22溶原性噬菌體P22 感染LT2（非溶原性）可能釋放帶trp+的P22LT22A (trp-)呈原養(yǎng)型。普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalized t

9、ransduction)噬菌體可誤包供體菌中的任何基因(包括質(zhì)粒)，并使受體菌實(shí)現(xiàn)各種性狀的轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) complete transduction 形成了遺傳性穩(wěn)定的 轉(zhuǎn)導(dǎo)子(transductant)流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortive transduction)，在許多獲得供體菌DNA片段的受體菌內(nèi)，如果轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，其上的基因僅經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄而得到了表達(dá)。 能在選擇性培養(yǎng)基 平板上形成微小菌 落成了流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的 特點(diǎn)。局限轉(zhuǎn)導(dǎo)specialized transduction當(dāng)溶原菌群經(jīng)誘導(dǎo)后，其中極少數(shù)前噬菌體從宿主染色體脫落時(shí)產(chǎn)主錯(cuò)誤切割，從而把宿主的某些基因（

10、 前噬菌體位點(diǎn)兩端是細(xì)菌染色體的gal和bio，故形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體通常帶有g(shù)a1或bio）整合到噬菌體的基因組上 ，當(dāng)這樣的噬菌體侵染另一宿主菌時(shí)，噬菌體 DNA 與受體菌的 DNA 同源區(qū)段配對(duì)，通過(guò)雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性，而形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子（缺陷溶源菌）。噬菌體DNA的不正常切割丟失了自身部分基因，并被同等長(zhǎng)度的宿主基因所取代的噬菌體稱為缺陷噬菌體（defective phage）。如dgal或dbio。低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（1ow frequancy transduction, LFT），形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很低，只有10-4 10-6 。 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（high f

11、requancy transduction, HFT ），形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很高, 理論上可達(dá) 50%。 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)是雙重溶源的結(jié)果： E.coli k12 E.coli K12(/dgal )F dgal UV 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（gal） 轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落 輔助噬菌體（） 噬菌斑 溶源轉(zhuǎn)變(lysonenic conversion)當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象。當(dāng)宿主喪失這一噬菌體時(shí)，通過(guò)溶源轉(zhuǎn)變而獲得的性狀也同時(shí)消失。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)有本質(zhì)上的不同，首先是它的溫和噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；其次，這種噬菌體是完整的，

12、而不是缺陷的。溶源轉(zhuǎn)變的典型例子是不產(chǎn)毒素的白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae) 菌株在被噬菌體感染而發(fā)生溶源化時(shí)，會(huì)變成產(chǎn)白喉毒素的致病菌株。接合conjugation通過(guò)供體菌與受體菌間細(xì)胞相接觸而傳遞大段DNA的過(guò)程。1946年，Lederberg和Tatum的E.coli k12營(yíng)養(yǎng)缺陷型株混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。E.coli k12兩個(gè)突變株bio- met- the+ leu+bio+ met+ the- leu-兩種菌混合培養(yǎng)后，出現(xiàn) 原養(yǎng)菌（bio+ met+ the+ leu+） 可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。細(xì)菌接合現(xiàn)象研究得最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌

13、是有性別分化的。決定它們性別的因子稱為F因子(即致育因子或稱性質(zhì)粒)，呈超螺旋狀態(tài)，具有自主的與染色體進(jìn)行同步復(fù)制和轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中去的能力。也可插入(即整合)到染色體組上；它既可經(jīng)過(guò)接合作用而獲得，也可通過(guò)一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、絲裂霉素C、硫酸十二酯鈉、亞硝基胍、利福平、溴化乙錠、環(huán)己亞胺和加熱等)的處理，而從細(xì)胞中消失。F因子的分子量為5107。在大腸桿菌中，F(xiàn)因子的DNA含量約占總?cè)旧w含量的2%。F 因子的存在方式及其相互關(guān)系 F+菌株 含F(xiàn)質(zhì)粒，細(xì)胞表面產(chǎn)生性毛(sex pili)，與F-細(xì)胞相連，在接合后轉(zhuǎn)移DNA。 F-菌株 無(wú)F質(zhì)粒，不 產(chǎn)生性毛，可 接受

14、外來(lái)F質(zhì)粒。Hfr菌株高頻重組菌株（high frequency recombination）。與F-接合后，重組頻率比F+高幾百倍。在Hfr細(xì)胞中，存在與染色體特定位點(diǎn)相整合的F因子(產(chǎn)生頻率約10-5)。當(dāng)它與F-菌株發(fā)生接合時(shí)，Hfr染色體在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變成線狀。整段線狀染色體轉(zhuǎn)移至F-細(xì)胞的全過(guò)程約需100 min。在轉(zhuǎn)移時(shí)，由于斷裂發(fā)生在F因子中，所以必然要等Hfr的整條染色體組全部轉(zhuǎn)移完成后，F(xiàn)因子才能完全進(jìn)入F-細(xì)胞。但轉(zhuǎn)移過(guò)程中斷，所以越在前端的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，故在F-中出現(xiàn)重組子的時(shí)間就越早，頻率也高。F菌株當(dāng)Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離其染色體

15、組時(shí)，可形成游離的攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱F因子。攜帶有F因子的菌株，其性狀介于F+與Hfr之間，這就是初生F菌株。初生F菌株與F-菌株接合，可使后者轉(zhuǎn)變成F菌株，這就是次生F菌株，它既獲得了F因子，又獲得了來(lái)自初生F菌株的若干遺傳性狀。以這種接合來(lái)傳遞供體菌基因的方式，稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(F-duction)、性導(dǎo)(sexduction) 。在次生的F群體中，大約有10%的F因子重新整合到染色體組上，而恢復(fù)成Hfr菌。原生質(zhì)體融合 通過(guò)人工的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合并產(chǎn)生重組體的過(guò)程稱為原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）。微生物細(xì)胞融合的研究開始于

16、1976年。其一般原理和主要過(guò)程是：先準(zhǔn)備兩個(gè)有選擇性遺傳標(biāo)記的突變株，在高滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿溉コ?xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體離心聚集，并加入促融合劑PEG(聚乙二醇)促進(jìn)融合，然后在高滲溶液中稀釋，涂在能使其再生細(xì)胞壁或進(jìn)行分裂的培養(yǎng)基上，待形成菌落后，通過(guò)影印接種法，將其接種到各種選擇性培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否是重組子。基因轉(zhuǎn)座 gene transposition轉(zhuǎn)座子的特征是在兩端有IR序列 ，分兩類：型Compound transposons：兩端為IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。型Complex transposons：兩端為IR(

17、3050bp)，中間為轉(zhuǎn)座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。第三節(jié) 真核微生物的基因重組 有性雜交 準(zhǔn)性生殖 準(zhǔn)性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種生殖方式，它可使同種生物不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，不經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂的方式而導(dǎo)致低頻率的基因重組并產(chǎn)生重組子。粗糙脈孢菌的有性雜交準(zhǔn)性生殖：準(zhǔn)性生殖包括下面四個(gè)過(guò)程菌絲聯(lián)結(jié)，異核體形成，核配體細(xì)胞交換和單倍體化四個(gè)階段。第四節(jié) 微生物基因突變和誘變育種 基因突變突變（mutation）指DNA順序上核苷酸發(fā)生置換或其它順序上的改變。突變類型堿基對(duì)置換substitution 轉(zhuǎn)換transition： 顛

18、換transversion：移碼突變frame-shift mutant染色體畸變chromosomal aberration deletion、duplication、insertion、translocation、inversion基因突變表型形態(tài)突變型生化突變型營(yíng)養(yǎng)缺陷型auxotroph；抗性突變型；抗原突變型致死突變型 條件致死突變型 其他突變型如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量以及對(duì)某種藥物的依賴性突變型等。基因突變的特點(diǎn)不對(duì)應(yīng)性自發(fā)性稀有性獨(dú)立性誘變性穩(wěn)定性可逆性 正向突變(forward mutation)回復(fù)突變 (back matation或reverse mutation）基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明一種觀點(diǎn)認(rèn)為，突變的原因和突變的性狀間是相對(duì)應(yīng)的，并認(rèn)為這就是“定向變異”、“馴化”。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，基因突變是自發(fā)的。實(shí)驗(yàn)證明：1943年S. E. Luria與M. Dlbruck進(jìn)行了Fluctuation test。1949年H. B. Newcombe的Respreding plated incubacion。1952年J. Lederberg夫婦用Replica- plating