植物保護研究技術(shù)昆蟲學關(guān)鍵研究部分

1、 植物保護研究技術(shù) 昆蟲學關(guān)鍵研究部分 前言一、課程性質(zhì)植物保護專業(yè)主干課程： 普通植物病理學、普通昆蟲學 農(nóng)業(yè)植物病理學、農(nóng)業(yè)昆蟲學 植物化學保護 植物檢驗檢疫學 植物保護研究技術(shù) 昆蟲生態(tài)與預(yù)測預(yù)報二、開課歷史 全國最早開課：分昆蟲研究法，植物病理研究法和植物化學保護研究法三門課。后合并為一門課。 三、內(nèi)容范圍 科學的內(nèi)涵必須借助于方法和技術(shù)展現(xiàn)其本來面目。植物保護學的發(fā)展離不開各種技術(shù)科學，其中包含著一切技術(shù)科學所給予的支持：以昆蟲學研究為例（1）昆蟲學的研究對象在地球上無處不在；（2）很難發(fā)現(xiàn)究竟有哪些技術(shù)不被昆蟲學所利用；（3）昆蟲學研究方法是技術(shù)科學總體中的一個很小分支 研究法：技

2、術(shù)+方法技術(shù) technique 或 technology，具體的實踐， 屬工藝范疇；方法 method 或 methodology，包含著某種設(shè) 計思想，引導(dǎo)科學實踐的一種程序和規(guī)范， 屬技術(shù)路線； 研究法，不是“實驗大全”，也不是“技術(shù)手冊” 植物保護學各類實驗以及科學研究方法中抽象出的一般性問題。從世界上昆蟲研究的發(fā)展來看經(jīng)歷了五個階段：采集昆蟲、制藏標本的觀察階段（observation stage）；分門別類、比較鑒定的分類階段（classification stage）；控制環(huán)境、對比飼養(yǎng)的實驗階段（experimental stage）；綜合結(jié)果、總結(jié)規(guī)律的理論階段（theori

3、zing stage）；摹擬法則、制定公式的數(shù)理階段（mathematical stage）。 隨著生命科學日新月異的發(fā)展，一些新的研究方法、新的技術(shù)在昆蟲學研究中有了廣泛的運用，為我們了解昆蟲的生活習性、對昆蟲分類及生物防治帶來了很大的方便。這些新方法新技術(shù)，包括生物化學技術(shù)、分子生物學技術(shù)、細胞遺傳學方法等已被越來越多的生態(tài)學家、昆蟲研究工作人員重視。 宏觀微觀的分子階段昆蟲學研究方法1、昆蟲學文獻2、昆蟲標本及形態(tài)學、解剖學實驗方法：昆蟲繪圖3、昆蟲標本及形態(tài)學、解剖學實驗方法：整體制片4、昆蟲組織學和超微結(jié)構(gòu)實驗方法：昆蟲組織切片及電鏡在昆蟲學中的應(yīng)用5、昆蟲攝影及顯微攝影6、昆蟲學飼

4、養(yǎng)技術(shù)7、昆蟲生理學、生物化學實驗技術(shù)8、昆蟲分子生物學技術(shù)9、昆蟲生態(tài)學及農(nóng)業(yè)昆蟲學實驗技術(shù) 10、計算機在昆蟲學中的應(yīng)用 植物保護學文獻檢索一 文獻檢索方法1、常用法 檢索工具查找文獻 順查法 從遠到近，各年逐查 倒查法 由近而遠2、追溯法 以文章后面所附的參考文獻為基礎(chǔ)，查找其它文獻資料，滾雪球3、分散法 分期分段，采用上述兩種方法二利用檢索工具查找昆蟲學文獻通過一定的檢索途徑和方法 1、幾種重要的檢索工具 (1) 利用館藏目錄查找昆蟲學文獻 中國圖書分類法 Q96 昆蟲學、Q966應(yīng)用昆蟲學 圖書目錄：書名目錄、 著者目錄、主題目錄 (2) 利用“名錄”、“辭典”查找昆蟲名稱等 拉英漢

5、昆蟲名稱 1983年 科學院 中國農(nóng)業(yè)害蟲名錄 1980年 中科院 (3) 檢索工具查找昆蟲學文獻 國內(nèi)： 全國報刊索引 分類途徑查找 （Q. 自然、科學技術(shù)；T. 生物科學；V. 農(nóng)業(yè)、林業(yè)） 科學技術(shù)譯文通訊 題錄形式分類 國外科技資料館藏目錄 中國科技情報所的文獻、16個分冊（農(nóng)業(yè)、林業(yè)、水產(chǎn)、生物學） 全國總書目（年刊）、全國新書目（月刊）、科技新書目（季刊） 國內(nèi)會議文獻通報（季刊） 國外： 動物學記錄 Zoological Record 1864， 倫敦動物學會， 1972年分成 21個分冊，昆蟲為13分冊 著錄格式：作者姓名、題目、期刊名稱、卷期、頁碼、圖表等 作者索引、主題索引

6、、地理索引、系統(tǒng)分類索引 (b) 生物學文摘 B. A.- Biological Abstract 1926年，110多個國家8686種期刊；1939年開始陸續(xù)分成12個分冊，其中包括1970年分出的昆蟲學文摘； (c) 昆蟲學文摘 A. E.- Abstract of Entomology, 1970年 著錄格式：文摘號、作者姓名、期刊名稱、卷期、頁碼及年份 （如為非英語，則括號內(nèi)注明原文文種及摘要文種）、題目（黑體）、文摘正文 作者索引、生物分類索引、類屬索引 generic index、概念索引 concept index、關(guān)鍵詞索引 subject index (key word)、組

7、配索引 cross index 2、計算機檢索 外文資源：AGRICOLA 、 AGRIS、 CABI、MEDLINE 、 Ovid、ISI Web of Knowledge 等中文資源：CNKI 中國知網(wǎng) （中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、 中國優(yōu)秀碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫、 中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫）萬方科技、萬方數(shù)據(jù)資源系統(tǒng)維普期刊 等ISI Web of Knowledge檢索平臺的 它集成了多個數(shù)據(jù)庫，可以進行跨庫檢索，也可以選擇單庫檢索。主要數(shù)據(jù)庫有： 1Web of Science（科學引文索引），： 2Journal Citation Reports（JCR），期刊引用報告： 3Derwe

8、nt Innovations Index（DII），德溫特世界專利創(chuàng)新索引： 4Essential Science Indicators（ESI），基本科學指標： 5INSPEC（SA）科學文摘： 6MEDLINE 醫(yī)學文摘： CNKI為國家知識基礎(chǔ)設(shè)施（National Knowledge Infrastructure）的簡稱，CNKI工程是由清華大學、清華同方發(fā)起，始建于1999年6月。 通過CNKI平臺，我校用戶可以檢索并下載:中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（全文年限：1994年以后）中國優(yōu)秀碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫（全文年限：1999年以后）中國博士論文全文數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)和全文（全文年限：1999年以

9、后）重要昆蟲學文獻一 常用昆蟲學重要著作 國內(nèi)：昆蟲分類學（上）蔡邦華 財政經(jīng)濟出版社 1956昆蟲分類學（中） 科學出版社 1973昆蟲分類學（下） 科學出版社 1985昆蟲生理學 王蔭長主編 中國農(nóng)業(yè)出版社 2004昆蟲生理生化學 王蔭長主編昆蟲生物化學 王蔭長主編 中國農(nóng)業(yè)出版社 2001中國經(jīng)濟昆蟲志中國動物志 昆蟲學辭典 國外： Imms, A. D. 1977 General Entomology (textbook)Snodgrass R. E. 1935 MorphologyWigglesworth, B. 1972 PhysiologySouthword, T. R. E.

10、1978 EcologyRockstein, M. 1978 BiochemistryMathews, R. E. & Mathews, J. R. 1978 BehaviourKerkut & Gilbert . 1985, 13vols. Comprehensive Insect Physiology , Biochemistry and PharmacologyGilbert, L.I. (ed.) 2004，7 vols. Comprehensive molecular insect science 二重要昆蟲學、植物保護學期刊：英文Ecological Entomology 生態(tài)昆蟲

11、學，1976創(chuàng)刊，季刊，英國Insect Biochemistry and Molecular Biology 昆蟲生物化學和分子生物學，1971，半季刊，英國Insect Molecular Biology 昆蟲分子生物學，1992，季刊，英國Journal of Insect Physiology 昆蟲生理學雜志，1957，月刊，英國Physiological Entomology 生理昆蟲學，1976，季刊，英國Systematic Entomology 系統(tǒng)昆蟲學，1976，季刊，英國Annual Review of Entomology 昆蟲學年評，1956，年刊，美國Environ

12、mental Entomology 環(huán)境昆蟲學，1972，雙月刊，美國Journal of Economic Entomology 經(jīng)濟昆蟲學雜志，1908，雙月刊，美國Canadian Entomologist 加拿大昆蟲學家，1868，雙月刊，加拿大Journal of Applied Entomology 應(yīng)用昆蟲學雜志，1914，半季刊，德國Plant disease 植物病害（美）Journal of Phytopathology 植物病理學雜志（德）Phytopathology 植物病理學（美）Journal of General Plant Pathology 普通植物病理學雜志

13、（日）European Journal of Plant Pathology 歐洲植物病理學雜志（荷）Molecular Plant Pathology 分子植物病理學（英）Archives of Environmental Contamination and Toxicology 環(huán)境污染與毒理學進展（美）中文昆蟲學報，昆蟲知識，昆蟲分類學報動物學報，動物分類學報，動物學研究植物保護學報，植物保護，植物檢疫植物病理學報，昆蟲天敵，中國生物防治農(nóng)藥學學報，農(nóng)藥，農(nóng)藥科學與管理、昆蟲繪圖 Drawing（一）繪圖的目的和意義1. 什么是昆蟲繪圖？運用繪圖這一特定的造型藝術(shù)手段（或方法），將昆蟲體

14、的外部形態(tài)特征、內(nèi)部解剖構(gòu)造、細胞組織特征、生態(tài)環(huán)境要素、群體自然景觀等內(nèi)容，作科學和形象表達的一種有效形式，是以昆蟲為主題的一種直觀性的藝術(shù)語言，它是生物繪圖的組成部分，是科學圖畫中的一個重要組成部分，是美學（繪圖藝術(shù)）與科學（生物學）互相滲透的產(chǎn)物。2. 昆蟲繪圖不能取代攝影確實有長處：真實性、速度敏捷、復(fù)制周期短繪畫的獨到之處： 可以表達各個部分、重點突出、清晰 最大限度地表達科學的真實性，在損傷、變形、殘缺、錯位、相互重疊遮掩的部分，予以復(fù)原 根據(jù)科學意圖，將各個部分加以恰當?shù)慕M合，使之成為一幅完整的畫面 器材設(shè)備相對簡單 制版印刷工藝過程簡單 出版部門歡迎繪圖，成本低3. 目的和意義

15、 為科學研究提供形象化資料；加深昆蟲自然信息的認識、理解； 促進昆蟲學科與相關(guān)學科的信息交流和推廣； 方寸之幅面，表達豐富內(nèi)容：昆蟲的主要特征和細微難辨的構(gòu)造； 通過繪圖實踐，可培養(yǎng)悉心研究、認真細致觀察的良好習慣，一絲不茍的工作態(tài)度，忠于科學、實事求是的優(yōu)良學風； 可以給教學提供有效直觀的效果4. 昆蟲繪圖的特點 以昆蟲為題材、 遵從科學的真實性 繪圖與文字有機結(jié)合、 服務(wù)于科學、科研和社會經(jīng)濟科學性準確，第一原則形態(tài)準確、比例協(xié)調(diào)、特征明晰質(zhì)量感真實感厚薄、軟硬、被毛或光滑、平整與粗糙、暗淡和光亮、光澤 具有一定的藝術(shù)效果生動，富于藝術(shù)魅力構(gòu)圖適當、姿態(tài)完美、合理用筆、色彩準確鮮明、層次適

16、當（立體感） 使用效果符合印刷要求（大小、線點） 畫面必須保持整潔（二）生物繪圖的種類1、表現(xiàn)題材的性質(zhì)來分 個體外部形態(tài)特征圖分類學、形態(tài)學 內(nèi)部解剖構(gòu)造圖形態(tài)學、比較解剖學、分類學 顯微玻片標本圖細胞學、組織學、超微形態(tài)學 示意圖解說性示意圖（生命過程、物質(zhì)運轉(zhuǎn)、相互關(guān)系） 生態(tài)景觀圖個體或群體生活習性內(nèi)部解剖構(gòu)造圖昆蟲消化道結(jié)構(gòu)圖生活史示意圖2、使用范圍來分 供印刷出版的描圖、圖版要求高 留作科研形象記錄的資料原圖 教學掛圖幅面大、線條粗、重點突出、表達清晰 科學普及宣傳圖形象生動、深入淺出、多為各層次群眾所接受3、從表達形式來分 黑白圖以白紙為底，單一黑墨繪就點線圖鋅板圖（凹凸）渲染圖

17、銅板，黑白層次 彩色圖水彩、油彩、水粉等4、從繪圖方法來分 實體描繪 顯微描繪 拷貝昆蟲黑白點線圖 引自李琦（三）黑白點線圖1、工具鉛筆（3H、H硬筆為好），橡皮，繪圖筆（水鋼筆），雙面刀片等2、材料繪圖紙，透明紙（硫酸紙），方格紙，墨水（碳素墨水）3、設(shè)備觀察板、圓規(guī)、九宮格、方格片、描繪儀、雙筒鏡、描圖架、直尺（四）繪圖步驟準備起稿定稿成圖整飾1、準備 物質(zhì)工具設(shè)備、材料、實物標本 業(yè)務(wù)知識昆蟲專業(yè)知識 + 繪畫技術(shù)2、起稿繪草圖、打輪廓繪草圖方法： 直接蒙繪大型平展昆蟲，如蝶蛾 反射描繪大型平展或不平展昆蟲，如蝶蛾、甲蟲、蝗蟲 尺規(guī)測繪 大、中型昆蟲， 如甲蟲、蝽象等要領(lǐng)：標定好基準線及

18、點的位置 （0、1、2、3、5）， 其次是找到適合的待測點 （10、11、12、14、4） 方格放大 采用透明塑料放大格，平放在蟲體上，通過方格觀察蟲體，再畫到繪圖紙上相應(yīng)的方格中去 投影放大 使用照象底片放大機、幻燈機、投影儀、顯微投影儀、電視轉(zhuǎn)播設(shè)備被放大的實物必須作成平板形透光體或幻燈片形式 復(fù)印機繪圖（縮微閱讀復(fù)印機） 繪制昆蟲翅脈圖，待繪標本須加工成平展、整潔、不留雜物污物 攝影繪圖 先將昆蟲拍照，洗印出放大的黑白照片， 再用蒙繪法勾畫輪廓及形態(tài)攝影繪圖法按像片圖象用碳素墨水畫出輪廓圖。涼干后，放入碘液中至褐色，約15分鐘 清水沖洗 大蘇打液5分鐘褪色 沖洗，晾干，則可得轉(zhuǎn)繪的圖像一

19、張。繪圖儀阿培式繪圖儀 （Abbecamera lucida）繪圖儀附件 （Camera lucida）主要由兩個直角棱鏡合成的立方體和一個反光鏡，在兩個棱鏡的膠合鈄面上涂有銀鏡，中央為透光孔Leica-MZ125-電子成像系統(tǒng) 王漫漫拍攝ZEISS-Stemi-SV6-繪圖儀王漫漫拍攝注意事項：安靜、耐心，一氣繪成，中途不能停頓背面圖頭向前；側(cè)面圖頭向左 對稱圖只畫半面；copy 完全對稱蟲體對稱、正反面特征都要畫的昆蟲，如蚧蟲標本大而鏡子視野小，分幾部分畫，拼湊 標本位置不好，整姿不好，科學修改 拼湊和修改時，硫酸紙蒙著從繪圖儀上描繪來的草稿草圖上畫錯的線條，修改過的地方，橡皮擦干凈，或作

20、出標記 圖的大小，起稿前應(yīng)“心中有數(shù)”，印刷的版面的2-4倍草稿上應(yīng)立即注明昆蟲名稱（或編號）、繪圖方法、放大倍數(shù) 愛護標本要求：1、圖的排列：背面圖，頭向上；側(cè)面圖，頭朝左。2、所繪的圖都要有文字說明，圖的各部分要注字，以虛線引出線條不得交叉，字要端正清楚。3、圖的大小應(yīng)與報告紙相適應(yīng)，蟲體各部比例要相稱。4、所繪的圖要力求與標本相像，并正確，在圖上要能明確的繪出蟲體的特征部位。5、圖在報告紙上的排列位置：繪圖時應(yīng)注意圖的數(shù)目在縱橫上的排列，如繪三個圖時，應(yīng)排列成品字形，而不應(yīng)倒品字形?？傊?，應(yīng)以美觀為原則。3、定稿全面校對、審定，修正、補充，標注4、成圖上墨或著色過程 碳素墨水、繪圖筆 點

21、線表示光線、濃淡、分界、凹點 線條細而均勻，兩邊光滑，點要點得圓、勻，粗細、疏密應(yīng)符合蟲體的明暗要求5、整飾剪貼標注比例尺法、數(shù)記法(X2)、示例等圖序、圖注修飾 軟橡皮擦、揭除、刀刮、白粉涂蓋用于生物分類學研究的顯微成像新技術(shù)UV-C光學共聚焦顯微圖像系統(tǒng)集成了光學和數(shù)字圖像分析技術(shù)，適用于采集非平面樣品（高度變化范圍超過了顯微鏡景深范圍）的圖像，可解決傳統(tǒng)光學顯微鏡成像時高倍數(shù)與大景深不能共存的問題，使樣品的不同高低部位都能清晰成像。UV-C系統(tǒng)由光學顯微鏡、專用光源、數(shù)碼成像設(shè)備、專用圖像處理軟件、高性能計算機組成。通過調(diào)節(jié)顯微鏡達到樣品的不同聚焦面，因為樣品表面的高低變化范圍超出了顯微

22、鏡的景深范圍，所以在任何聚焦面的圖像都只有局部是清晰的，將所有這些圖像用數(shù)碼成像設(shè)備記錄并傳輸?shù)接嬎銠C，然后交給UV-C的專用圖像處理軟件分析，最終即可合成出一幅全部清晰的高品質(zhì)圖片。、昆蟲整體及局部特征制片（一）昆蟲制片1. 什么是昆蟲制片： 非切片法 整體制片（不一定是整個制片，可以局部器官的封片，如足、觸角、翅、外生殖器） 涂片法血液 壓碎法染色體、昆蟲病毒、細菌等 浸漬分離法內(nèi)臟、肌肉等 切片組織切片法徒手切片 石蠟切片 冰凍切片 超薄切片法電子顯微鏡 2.目的意義形態(tài)特征、鑒定內(nèi)部器官、組織、細胞等構(gòu)造病理、生理變化 （二）昆蟲整體制片 從化石、琥珀得到啟發(fā)而進行，此玻片可以永久保存

23、（太陽不能曬），一般可以保存10-70年。 1、要求 材料透明，光線可以通過，顯微鏡可以觀察 不含水份（脫水徹底） 封固劑材料及透明劑的折光率與玻璃折光率一致加拿大樹膠 1.52 玻璃1.518 2、制作工具載玻片 Glass slide常規(guī)：標準75 X 25mm，邊緣光滑；特殊規(guī)格 50X25、75 X 37、75 X 50mm厚度：，平均1mm，油鏡下觀察，暗視野照像；要求：化學藥品不腐蝕的玻璃特殊：凹玻片 Hollow glass，雄性外生殖器等 蓋玻片 Cover glass形狀：方形 長15、18、20、22mm 長方形 50 X 24mm 圓形 直徑15、18、20mm（國內(nèi)無）

24、厚度：0.07-0.13高倍油鏡 0.13-0.17次高倍油鏡 0.17-0.25中倍油鏡 0.25 低倍油鏡要求：厚薄相同（進口）、無花紋、無氣泡、保存時應(yīng)放入干燥器或洗干凈浸入75-95%酒精（Alc）中解剖針、刀、圈針、尖頭鑷子、玻片鑷子解剖針圓竹或玻璃棒 + 0或00號昆蟲針解剖刀醫(yī)用，或用剃須刀片自制圈針圓竹或玻璃棒 + 昆蟲針（彎頭） 染色皿、染色碟、培養(yǎng)皿、小燒杯（1套）、酒精燈等3、玻片制作的步驟 常規(guī)制作、快速制作、 直接制作A.常規(guī)殺死浸軟水洗脫水染色透明封固標簽殺死Killing水生昆蟲熱水，水合乙醛陸生昆蟲乙醚、氰化物、熱水、冷凍、乙酸乙酯等解剖生理鹽水，0.85%Na

25、Cl 或在水中（蒸餾水）浸軟和凈化 Soaking & Cleaning通常5-10% KOH 、微小昆蟲 3-5%NaOH除去內(nèi)臟、肌肉、脂肪等，退色時間，憑經(jīng)驗 昆蟲類群有關(guān)昆蟲大小有關(guān)，體壁厚薄有關(guān)方法：浸幾小時幾周 或 水浴加熱 水洗 Washing with water操作要仔細，以免將材料沖掉流水沖洗 Running water or tap water沖洗要徹底，洗盡KOH或NaOH；有時可以加點10%HCl中和堿性吸管沖洗：吸管吸水沖洗 脫水 Dehydration使組織中的水份完全除去，并使組織變硬，否則會影響后面的染色、透明超薄切片，丙醇（電鏡）其它切片，酒精（乙醇Alc）

26、，梯度 30%50%70%85%95%100%染色皿 中染色 Staining不是所有材料都要染色；標本透明度一致，不同組織和部分分界不清時，染色使之分清染色劑種類：a.酸性復(fù)紅（品紅）（鹽酸薔薇苯胺） 70-75%Alc作溶液，濃度2%b.固綠（快綠）fast green，效果好，10年不退色、 95%Alc溶液，濃度2%c.硼砂洋紅 Borai Carmine4%硼酸水溶液100ml + 洋紅2-3g（胭脂紅，來源于蚧殼蟲，8萬只雌提取1磅）煮30分鐘加水保持100ml + 等量70%Alc24小時過濾染色時間：3-4天，酸Alc(酒精中滴醋酸) 鮮紅色d. 酸蘇木精液 Ehrlichs

27、haematoxylin進口蘇木精染色方法：脫水70%時染色深蘭黑色e. 氯唑黑E Chlorazol Balck幾丁質(zhì)染色 70%Alc飽和液脫水至70%Alc時，染色，2090%Alc沖洗95%細胞核黑色細胞質(zhì)灰色幾丁質(zhì)黑綠透明 Clearing 使組織中的酒精（或丙醇）被透明劑所代替（使石蠟很順利地進入組織中），增加組織的透明度（折光率），并能和封藏劑混合二甲苯、香柏油、苯、丁香油、松節(jié)油、木餾油、松節(jié)油+木餾油（1:1）、石碳酸+二甲苯（1:3或1:1）、酸、二甲苯+丁香油（3:1）等 一般用二甲苯丁香油、松節(jié)油、木餾油等可用于快速封藏，將組織直接加入，2-4天，取出過二甲苯，封藏封藏

28、 Mounting加拿大樹膠 Canadian Balsam, 100g/100元，冷杉樹，二甲苯作溶液中性樹膠，國產(chǎn)100g/16元，不太穩(wěn)定冷杉膠 貼標簽反貼，左側(cè)，背面注意事項a. KOH或NaOH浸軟清除后，大材料流水沖洗，小材料吸管沖洗，b.脫水酒精要貼標簽，加蓋，防止蒸發(fā)c. 染色時染色劑濃度與脫水濃度一致d.移動小蟲子時，要用圓針，不用鑷子e.脫水時，盡量少帶下一級濃度Alc到上一級，尤其在90%以上f. 標本在二甲苯中不可太長g. 封片要在晴天進行，或酒精燈上h.避免呼吸時的氣泡i.蓋蓋玻片時，盡量防止氣泡進入j. 樹膠的量憑經(jīng)驗，不要太多，也不要太少k.注意材料在玻片上的位置

29、，應(yīng)在中間l.封藏好后的玻片要平放在玻片架上，自然干燥或干燥箱內(nèi)烘干B、快速和直接法 （小蟲子和蚜蟲）a.快速 材料 木餾油，1-2天封片b.直接封片 Hoyers液，在玻片上自行干燥 (Hoyers液配方：阿拉伯膠 15g , 甘油 10ml , 水合三氯乙醛 100g , 蒸餾水 25ml) 、昆蟲組織切片及電鏡應(yīng)用一、石蠟切片（石蠟制片法，Paraffine method）1.用石蠟作浸透劑，做組織切片2.切片的厚度一般在2-10（10-6m），也可達(電鏡可達50 m，即500A）3.用于組織學、胚胎學、細胞學、病理解剖學等4.雖然電鏡應(yīng)用越來越廣，但石蠟切片還是不可或缺的5.組織切片

30、可用X光分析二、制作過程活體上切取組織固定沖洗（將固定液洗掉）脫水（梯度Alc）透明（去掉酒精）浸蠟透入（低高溶度蠟）包埋切片貼片脫蠟復(fù)水染色）脫水透明封藏標簽1、殺死和固定 Killing & fixing殺死：可用乙醚或三氯甲烷麻醉，或用氰化鉀快速殺死固定：防止自解，細胞中物質(zhì)不解體、細胞組織不皺縮固定液：穿透力強，速度快，中止新陳代謝作用防止生物自解、保持標本組織細胞結(jié)構(gòu)盡可能保持活體狀態(tài)對組織化學分析起到媒染作用 實質(zhì)上：與蛋白質(zhì)結(jié)合沉淀，蛋白質(zhì)變性 固定液種類 Fixative 種類很多，有單成份的，更多的是復(fù)合的 醋酸 Acid CH3COOH殺死快，穿透率強，對原生質(zhì)，線粒體等起

31、破壞作用，保存染色體，沉淀核蛋白、糖蛋白；但使組織膨脹、柔軟固定濃度：50%，1hrs （17時結(jié)冰）升汞 Bichloride of mercury, HgCL2 7.4%飽和液常用飽和；良好固定液，穿透力快，可沉淀所有蛋白；但使組織收縮、發(fā)脆，染色效果好酒精 Alchol, CH3CH2OH 70-100%穿透力快，沉淀蛋白，常用的脫水劑；但使組織收縮，染色困難，與鉻酸、鉻酸鹽類不能混用福爾馬林 formalin, HCHO 30-40%甲醛固定液濃度 4-10%穿透力快、速度較乙醇慢；組織收縮顯著，但均勻，染色效果好，可以單獨使用苦味酸 Pieric acid, C6H3(NO)3OH

32、飽和溶液濃度（易爆）殺死快、穿透力強、組織發(fā)硬，收縮逐漸進行；與福爾馬林混用，可以增強穿透力，若再加醋酸可減少收縮布安氏液 Bouins fixing fluid 世界著名固定液苦味酸 75 福爾馬林 25醋 酸 5殺死快、穿透力強、組織不硬化、收縮，易染色（尤其是蘇木精）固定材料注意事項a.組織材料必須新鮮b.切取材料時注意方向c.切取用刀要鋒利，切忌擠壓d.取材大小，一般大小組織學 0.5 X 1X 1 cm，面積不超過1cm2細胞學0.5 X 0.5X 2 cm，面積不超過2e.材料與固定液 1:20f.固定材料要寫清楚標簽2、沖洗流水沖洗 70%Alc保存酒精沖洗 70%Alc保存目的

33、：將固定液全部沖洗掉，如Bouins液黃色3、脫水 Dehydration去掉組織內(nèi)水分，梯度Alc 30%, 50% 75%, 85%, 95%, 100% Alc每級脫水時間與材料體積大小成正比脫水過程需中途停止或過夜，應(yīng)在70%酒精中4、透明 clearing二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油、苯胺油脫水石蠟進不去脫水100%Alc二甲苯可以100%Alc:二甲苯3:11:11:3脫水要干凈，若不干凈，組織中有空洞，半乳白色5、透入（透蠟）infittrating石蠟有熔點 melting point （m. T ）熔點低，石蠟軟；熔點高，則硬；一般在42-56（2一檔） 熔點強度與

34、切片厚度的關(guān)系 切 片 室 溫 3-5 5-8 8-10 13-16 56 54 52 17-21 60 57 54 22-24 64 60 60 做切片標本時最好的氣溫是5-10月份。透蠟要求：石蠟滲入到細胞各個部分，連氣泡部分也應(yīng)滲入氣泡中；石蠟要與組織完全成為一體，不可分離石蠟：二甲苯 1/4：3/41/2：1/23/4：1/4石蠟（100%）熔點：50525456，每級15-20分鐘，2小時完成石蠟洗滌方法：熱水 稀硫酸、或二甲苯6、包埋 embedding石蠟完全滲透，移入包埋用紙盒（高1cm），然后冷卻，組織則包埋于蠟中。包埋過程中可能會出現(xiàn)白色小顆粒情況，象雪花一樣，這可能：包埋

35、前：a. 脫水不干凈b. 組織內(nèi)或石蠟內(nèi)混有透明劑c. 石蠟本身質(zhì)量不好（欠佳）包埋中：a. 組織塊移入時，包埋盒中石蠟已凝固；b. 移動組織塊時，包埋盒中石蠟已凝固；c. 石蠟冷卻慢，需要驟然冷卻（通常放入冷水）7、切片 Sectioning切片機種類 microtome旋轉(zhuǎn)式（搖動式，輪轉(zhuǎn)式等）、滑行式切片刀 microtome knifea.雙面刀 單凹面刀 雙凹面刀 （常用） （火棉膠） （不常用）b.刀片鋒口應(yīng)在100X顯微鏡下觀察無裂痕c.磨刀石，油石，天然（外國進口），磨刀時，應(yīng)在磨刀石上放些石蠟油或肥皂水d.保存，用二甲苯擦干凈保存修整 Trimming石蠟塊底面正棱形、方形切

36、片a.準備工作b.蠟塊（修切好的蠟塊）裝在臺木上c.調(diào)整切片的厚度，先厚后薄，4-6，1-2d.放上刀片，調(diào)節(jié)蠟塊與刀面平行e.慢慢使蠟塊靠近刀片f.切片刀與蠟塊角度，雙面刀9-12，（7-12）g.切片的速度40轉(zhuǎn)/分，左手持毛筆，把蠟帶（拖）抬起8、貼片將切下的石蠟帶粘貼在載玻片上蛋白粘片劑，梅氏 Mayers Albumen 配制方法： 蛋白（雞） 50ml + 甘油 （丙三醇） 50ml+防腐劑（麝香草酚、水揚酸鈉各1g）反面光滑、有光澤；放在水浴鍋上，50，低于石蠟溶度3-5，使石蠟片展平；并不斷滴水（蒸餾水）9、脫蠟及復(fù)水在染色缸中進行，脫蠟（二甲苯），20左右（與室溫有關(guān)）復(fù)水1

37、00%Alc:二甲苯（1:1）100%Alc95%Alc 蒸餾水10、切片染色a. 染色目的： 因為生物組織、細胞內(nèi)含物都是淡色，透明的，不易觀察，有的會看不見，而且目前生物化學的發(fā)展，對生物組織的染色要求越來越高，通過染色，不同的部分染上不同的顏色。b. 染料分類 來源分 天然染料：蘇木精、洋紅（胭脂紅、片紅），靛青 人工染料：煤焦油染料，苯胺，苯衍生物（芳香族）化學反應(yīng) 堿性染料：溶于水和Alc中，色堿鹽、氯化物，硫酸鹽，醋酸鹽等 助色用-NH3，-N 如蘇木精，番紅，美蘭 酸性染料：溶于Alc和水中，色酸鹽、鈉鉀鈣鹽 助色用-OH，-COOH，-SO3H硫酸基 如伊紅，亮綠，深紅，復(fù)紅

38、中性染料：酸堿染料相混而成，也稱復(fù)合染料，如芮氏Wright染色劑、Giemsa染料注：作用基團是酸性或堿性染色對象 細胞核：蘇木精、胭脂紅、番紅、結(jié)晶素、孔雀綠（堿） 甲苯胺蘭、美蘭、甲基綠 細胞質(zhì)：伊紅Y，淡綠，桔黃G，酸性復(fù)紅，快綠，苦味酸，（酸） 水溶性苯胺蘭 脂 肪：蘇州、，蘇州黑c. 染色原理與工業(yè)上染色差不多，有化學學說、物理學說；由于1945年以來，組織化學的發(fā)展，認為化學物理作用的綜合物理：毛細管滲透作用 組織、吸收 吸附作用（分子引力作用）化學：細胞內(nèi)，有酸、堿部分，如核酸往往與堿性染料有親和力，細胞質(zhì)則通常與酸性染料作用 蛋白質(zhì)（兩重性）：在酸性溶液中，顯堿基性，與 “-

39、” 結(jié)合 在堿性溶液中，顯酸基性，與“+”結(jié)合溶液PH值高于組織等位點，組織酸性，則與堿性染料結(jié)合 溶液PH值低于組織等位點，組織堿性，則與酸性染料結(jié)合d. 媒體向?qū)в行┤玖?，沒有媒染劑，無法染色；媒染劑即能與生物組織作用，又能與染色劑作用，一般都是沉淀作用通常是鋁鹽、鐵鹽（明礬）e. 染色方法漸進染色法 progressive method 由淺深后退法 retrogressive method 由深淺（退色）所有染色程序：先染堿性酸性 蘇木精 伊紅 （核） （質(zhì)）11、封藏12、標簽三、電鏡在昆蟲學中的應(yīng)用1、應(yīng)用a.超微形態(tài)學 ultra structureb.組織學、細胞學、發(fā)生學、遺

40、傳學等，細胞器、染色體、精細胞、卵細胞等，電鏡細胞化學技術(shù)c.生理生化、病理學等，如病毒、細菌的觀察和檢查； 免疫學 免疫電鏡技術(shù) 電鏡放射自顯影技術(shù)等d.昆蟲生物大分子結(jié)構(gòu)等e.圖版2、原理和方法（1）電鏡簡介透射電鏡 Trasmission electronic microscopy, TEM 以高能微束電子流穿透樣品，經(jīng)過樣品內(nèi)結(jié)構(gòu)散射，再聚焦而成像掃描電鏡 Scanning electronic microscopy, SEM利用高能微束電子流轟擊樣品表面，使之發(fā)出多種信號，再收集其中某種或某些信號加以處理放大而成像共同點：兩者都以高能微束電子流作照明源不同點：對樣品的處理上不同TEM

41、 要求對樣品作電子染色處理（加強結(jié)構(gòu)散射）、包埋、超薄切片等SEM 則要求對樣品作導(dǎo)電處理，噴涂金屬、組織導(dǎo)電技術(shù)等（2）樣品制備a.透射電鏡（超薄切片）取材固定沖洗脫水浸透包埋切片染色觀察新 前后 磷 丙 環(huán)甲 500A 銅 鮮 二 次 酸 酮 氧基 玻 網(wǎng) 戊 四 緩 樹丙 璃 電 二 氧 沖 脂稀 刀 子 醛 化 液 酸 染 鋨 色 醋酸鉛液b.掃描電鏡直接使樣品帶電臨界點干燥法：材料洗凈固定洗凈脫水（逐級進行）O2/（液汽）干燥鍍金觀察固定：10%戊二醛，1小時 1%鋨酸，2小時脫水：丙酮噴涂：導(dǎo)電處理，一般用真空噴涂法，在高真空中以大電流、低電壓、加熱噴涂金屬（黃、白金），形成100

42、-200A厚的金膜而導(dǎo)電，噴涂后即可觀察例：白背飛虱觸角感器掃描電鏡觀察引自孫虹霞等白背飛虱觸角感器掃描電鏡圖St：毛形感器Sc：刺形感器Sa：耳狀感器引自孫虹霞等，2006白背飛虱觸角上菊花狀的感器簇 引自孫虹霞等，2006每個感器簇由23-33個毛形感器和耳狀感器聚合而成，感器緊密排列成圓形.昆蟲飼養(yǎng)技術(shù)Insect Rearing一、昆蟲飼養(yǎng)目的及方式1目的： 生物學（生長、發(fā)育、生殖）研究 行為學（行為、習性）研究 生態(tài)學（溫、濕度、光照與生長發(fā)育的關(guān)系、寄生與天敵關(guān)系）研究 昆蟲生理學等研究 殺蟲劑藥效的研究 昆蟲標本的收集 生物防治大量釋放天敵等2方 式完全飼養(yǎng) 生活史 卵成蟲卵部

43、分飼養(yǎng) 某個階段 幼蟲蛹， 蛹成蟲卵室外飼養(yǎng) 自然狀況條件下進行室內(nèi)飼養(yǎng) 人工控制條件下進行大規(guī)模飼養(yǎng) （大量繁殖）單種飼養(yǎng) 天然飼料飼養(yǎng) 以昆蟲自然條件下最喜愛取食的植物飼養(yǎng)人工飼料飼養(yǎng) 按昆蟲營養(yǎng)、習性而配制的各種配制飼料飼養(yǎng)二、飼養(yǎng)觀察的設(shè)備和器具1飼養(yǎng)室（養(yǎng)蟲室）田間養(yǎng)蟲設(shè)備養(yǎng)蟲室 在昆蟲發(fā)生區(qū)或鄰近處，有樹蔭，生態(tài)條件較好。其內(nèi)有水電、光照設(shè)備，地面為地板結(jié)構(gòu)，有工作室；紗網(wǎng)16-18孔網(wǎng)（目），（每平方英寸孔數(shù)）大養(yǎng)蟲籠(2)生化培養(yǎng)箱和人工氣候箱 自動控制溫度、光照、濕度(3)人工氣候室(4)溫室 室內(nèi)水電、光照，加熱系統(tǒng)2. 飼養(yǎng)器具及材料木質(zhì)有吸水性、養(yǎng)蟲籠不油漆(2)玻璃、

44、塑料、有機玻璃 透明、透光；無吸水性，易積水，太陽曬則升溫指形管 0.84，18，1.58，28，412cm培養(yǎng)皿 6，10，15cm廣口瓶、玻璃罩、水槽(3)金屬材料堅固，不透水，無吸水性。(4) 陶器盆載、罐（越冬蟲態(tài)）(5)纖維材料 脫脂棉、棉布、紗布、吸水紙其它工具：自行設(shè)計， 毛筆，鑷子，解剖鏡等三、飼養(yǎng)小氣候因子的測定和控制溫度、濕度、光照、風速、蒸發(fā)、土壤含水量1溫度 1535，2025 溫度計、高低溫度計、溫度儀 加熱：燈炮、電爐、空調(diào)、取暖器 降溫：冰水、空調(diào) 恒溫：培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、人工氣候箱2、濕 度 更為重要、也更難控制 首先了解是否喜濕（蒼蠅等雙翅目幼蟲喜濕） 濕度

45、不能太低，不能存活；太高易感染疾病 干濕球溫度計、毛發(fā)濕度計、自計濕度計增濕空氣中灑水降濕生石灰、濃硫酸、氧化鈣恒濕空調(diào)（或飽和鹽溶液），人工氣候室（箱）3光照60W白熾燈、日光燈短光照能引起很多昆蟲滯育。對長日照昆蟲，飼養(yǎng)光照控制在14-16小時；倉貯害蟲可在黑暗條件下飼養(yǎng)4風速 通風設(shè)備5土壤含水量 土壤害蟲 倉庫害蟲 四、 飼養(yǎng)的一般技術(shù)和方法昆蟲習性，要仔細觀察，那怕是十分細小的細節(jié)，也要注意。如盲蝽，吃棉花葉的同時，要吃蚜蟲蜜露等1 成蟲補充營養(yǎng)天然飼料：植食性昆蟲，甲蟲、蝗蟲（玉米、麥子等）；寄生性昆蟲（蟲）人工飼料：液體或半液體，水、蜜糖，血液、牛奶固體：雙、膜用水果、干果、或（

46、瓊脂10%100ml+20g蔗糖+50g蜜切成條狀）2、交配產(chǎn)卵（成蟲）往往是難關(guān)飛行中交配：蜻蜒、雙翅目、膜翅目、蝶，飼養(yǎng)空間要大靜止時交配：蛾類，產(chǎn)卵要求場所，如草、紙（如粘蟲，蠶等）蝗蟲等土壤蚊水玉米螟等干燥、3、卵期 溫度，保濕 蟲期保存卵期冷貯（冰凍），4、幼蟲 食料新鮮，定期更換 沒有相互殘殺（密度適合） 高齡時，取食量大 衛(wèi)生清潔5、蛹 化蛹習性，是否入土化蛹、結(jié)繭供以紙條 雙翅目、鞘翅目沙土；蚊水 化蛹時，不能動6、飼養(yǎng)時的消毒和清潔工作a.干熱：160,1小時b.濕熱：蒸氣高壓鍋，25大氣壓，20分鐘 要放冷空氣c. 金屬： 1：50漂白粉，墻用石灰水刷白d. 室內(nèi)有條件用紫

47、外燈滅菌 或用消毒液清潔e. 養(yǎng)蟲時注意螨及其它天敵f. 各種器材（包括棉花、土壤都要消毒等）寄生性天敵昆蟲人工飼養(yǎng)技術(shù)隨著害蟲生物防治重要性的顯現(xiàn)，對害蟲寄生性天敵的需求日增，由此引發(fā)了研究寄生性天敵人工培養(yǎng)的熱潮，涉及的寄生天敵包括外寄生蜂，卵寄生蜂，幼蟲內(nèi)寄生蠅和蛹內(nèi)寄生蜂。如，成功地從卵一直飼養(yǎng)到成蟲的一種卵寄生蜂赤眼蜂（Tricogramma）。最早采用的方法是：在天然寄主上繁殖寄生性天敵最成功的例子是：卵寄生蜂，如赤眼蜂先用柞蠶卵制成卵卡暴露給赤眼蜂被寄生的卵卡釋放到田間赤眼蜂成蟲羽化出防治田間害蟲方法雖然有效，但成本高昂：首先必須大量種植害蟲寄主植物飼養(yǎng)目標害蟲取得寄主卵做成卵卡

48、寄生蜂寄生利用人工飼料在寄主體外培養(yǎng)寄生性天敵的研究始于1915年，但直到1954年，美國昆蟲學家House第一個用化學成分明確的化合物配制的人工飼料，成功培養(yǎng)出了一種石蠅Psudosarcophaga affinis Foll.。人工飼養(yǎng)寄生天敵的好處：實用性方面，工廠化、商品化，大規(guī)模生產(chǎn)使成本下降為寄生性天敵的生理生化研究提供了有效的平臺使調(diào)查化學農(nóng)藥對寄生性天敵影響的工作變得更加簡便易行人工飼養(yǎng)寄生性天敵的研究方法和技術(shù)主要包括：寄生性天敵卵的提取，三種方法（1）吸引并激發(fā)寄生性天敵直接產(chǎn)卵于人工寄主體內(nèi)。首先要造出與寄主形態(tài)相似的人工寄主（蠟或是塑料薄膜作為制造材料）；其次，注入人工

49、寄主體內(nèi)的液態(tài)物質(zhì)除了能吸引并激發(fā)寄生天敵產(chǎn)卵外，還能為寄生天敵的胚后發(fā)育和幼期發(fā)育提供必需的營養(yǎng)（2）從被重寄生（superparasitism）的寄主中取卵。應(yīng)用最廣的方法是將少量寄主暴露給大量的雌性寄生性天敵，然后解剖被寄生的寄主，能獲得大量的卵一般獲取處于胚胎發(fā)育后期的卵（在寄主體內(nèi)發(fā)育了20-24h）比較普遍，其在人工飼料中的孵化率接近100%（3）直接從雌性寄生性天敵的卵巢中取卵此法簡便易行，但有一定的局限性。一是卵巢中的卵尚未授精，只能產(chǎn)生雄性的后代；二是因為卵巢中的卵沒有經(jīng)過產(chǎn)卵器的物理性擠壓而無法發(fā)育此種方法一般不被采用人工飼料的配制獲取足夠的卵以后，最關(guān)鍵的下一步是人工飼料

50、的配制，而人工飼料的營養(yǎng)成分種類和比例是關(guān)鍵的關(guān)鍵因為一般寄生性天敵（尤其內(nèi)寄生性天敵）的卵所含營養(yǎng)很少或完全沒有，其生長發(fā)育所需的營養(yǎng)主要依靠其寄主寄生性天敵所需要的各類化合物：氨基酸和蛋白質(zhì)類脂化合物甾醇類化合物碳水化合物維生素及其他特異的生理生化營養(yǎng)元素無機鹽類化合物五、飼養(yǎng)記載詳細、及時、準確1成蟲（A）：羽化、活動、趨性（光、化）、交配（次數(shù)）、產(chǎn)卵（數(shù)量，場所，方式等）、性別、壽命、補充營養(yǎng)、習性差異、天敵2卵（E）：寄主（產(chǎn)卵）、排列、覆蓋物、卵色變化、歷期、孵化率、天敵、孤雌生殖等3幼蟲（L）：孵化時期，卵殼（是否掉）開始取食時間、取食部位、 取食量（高、低）、量與氣候關(guān)系、高

51、低齡食量差別、脫皮次數(shù)、頭殼、體長變化越冬幼蟲習性、滯育、對光反應(yīng)歷期、天敵、擬態(tài)4蛹（P）：化蛹場所、繭（繭、土繭）、蛹期長短、蛹色變化、死亡率、羽化期5越冬：場所、時間昆蟲生活史的科學記述方法1、文字描述法 早期常用的方法如：棉綠盲蝽 2、公式法引自彩萬志，20013、表格法4、圖示法六、人工飼料80年代，昆蟲營養(yǎng)。80年代后發(fā)展很快，這與生理、毒理、病理有關(guān)，與農(nóng)藥治理問題、生防、遺傳不育、引誘等研究，需要整齊劃一的昆蟲1目的： 大規(guī)模飼養(yǎng)天敵、資源昆蟲 新技術(shù)防治害蟲 微生物防治害蟲 殺蟲劑篩選 信息素等生物測定 昆蟲營養(yǎng)生理學研究2類 型 基礎(chǔ)是營養(yǎng)學昆蟲營養(yǎng)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物

52、動物一樣 甾醇、不胞和脂肪酸 維生素類，A、B、C、D、E等 類型全純飼料：化學藥品配，無生物物質(zhì) 往往用于昆蟲營養(yǎng)研究 成本高，飼養(yǎng)效果難達到自然生長的水平半純飼料：化學藥品為主，加來自植物/動物/微生物物質(zhì)（未經(jīng)提純的粗制物）如植物組織，肝，酵母等往往實驗室內(nèi)研究中飼養(yǎng)昆蟲實用飼料：加入寄主植物成份配制而成，如大豆、大麥胚（半合成飼料）往往用于大規(guī)模飼養(yǎng) 要加防腐劑，化學防腐劑 飼料有的要做成一定形態(tài)，如纖維狀。成本低，配法簡單，但飼料中各營養(yǎng)成分的比例較難掌握 配方： 忻介六 教科書例：粘蟲的飼料組成（克）大豆粉；啤酒酵母；干酪素；纖維素粉；玉米葉粉；蔗糖；瓊脂；膽固醇；抗壞血酸；山梨酸

53、；對-羥基苯甲酸甲酯；自來水120ml、昆蟲生理生物化學實驗技術(shù)昆蟲生理學的范圍很廣，其實驗技術(shù)也隨之而涉及各個領(lǐng)域。主要：.昆蟲血淋巴的一般操作技術(shù) .昆蟲電生理技術(shù) .昆蟲內(nèi)分泌學及激素實驗技術(shù) .同位素技術(shù)（在昆蟲生理研究中的應(yīng)用） .檢壓技術(shù)（呼吸系統(tǒng)，呼吸量的檢測） .取食量、食物利用率測定（消化系統(tǒng)）一、昆蟲血淋巴的研究方法血淋巴 ： 血細胞類型：原血胞Prohemocyte 漿血胞Plasmatocyte 粒血胞Granulocyte 珠血胞Spherulocyte 類絳血胞Oenocytoid 血漿1、血細胞的研究血細胞的觀察方法.活體觀察 借一些昆蟲身體的透明區(qū)，如翅或附肢等

54、，將其浸于甘油或鏡油后以薄的蓋玻片夾住，在高倍顯微鏡下觀察，可見血細胞在其中循環(huán)。此法對翅厚、血淋巴少或血細胞小的種類效果不好，有很大局限性。.體外染色法 應(yīng)用十分廣泛 (1)固定與取血 因昆蟲血液易于凝聚，往往在制成血涂片前已聚集成團而導(dǎo)致形態(tài)失真或無法計數(shù)，因此最好在取血前先行固定。方法：（i）溫度固定。將昆蟲在55-65熱水中浸泡1-10分鐘后取血滴于載玻片上，用蓋玻片將血滴推拉成薄膜,涼干后染色。 （ii）化學固定。直接將昆蟲血淋巴滴入化學固定劑（5%福爾馬林或的戊二醛)中，血淋巴充分混勻后制成血涂片空干，染色前要將固定液漂凈。(2)染色 方法很多，其中以Giemsa染色效果較好，且操

55、作方便。Giemsa染色又分為：（i）速染：配制（1滴濃染料/ml蒸餾水內(nèi)）的)Giemsa稀釋液，將血涂片直接浸入3-5分鐘，鏡檢適度后用蒸餾水沖洗1分鐘吸干水分封裝（加拿大膠永久封存；甘油或鏡油暫封）。(ii)長染：空干后血涂片浸入Giemsa稀釋液中20分鐘-2小時蒸餾水沖凈后短暫浸入加有幾滴碳酸鋰的H2O中（為辨識染成紅色的結(jié)構(gòu)）H2O沖洗后再短暫浸入加有幾滴稀鹽酸的H2O中（為辨識染成藍色的結(jié)構(gòu)）H2O沖洗后鏡檢，染色過重則重復(fù)上兩步擦干水分加拿大膠封存。.相差顯微鏡觀察法相差顯微鏡由于操作方便，又具有適于觀察活體、立體等的優(yōu)點，應(yīng)用于觀察昆蟲血細胞十分廣泛。在載玻片上滴一小滴液體石

56、蠟， 再滴入昆蟲血淋巴，立即蓋上蓋玻片即可 利用不同倍數(shù)的相差鏡頭進行觀察，均可獲得良好效果。.電子顯微鏡，掃描電鏡法： 觀察血胞內(nèi)、外的超微結(jié)構(gòu)。.同位素放射自顯影技術(shù)的應(yīng)用： 追蹤各類血胞間的轉(zhuǎn)化等 關(guān)系。2、 血淋巴研究方法（測定血淋巴的理化特性）由于昆蟲個體小，血淋巴量又很少，且某些昆蟲的血淋巴離體后很快凝結(jié)和變黑，故取血淋巴要求快速、精確、不變性。樣品收集一般方法 較大的昆蟲，可用刀片或剪刀直接從表皮切口使血淋巴流出，通常取血部位在翅、足基部。注意問題： 量若提取蛋白，需足夠量；若分析用，微量即可 防止血淋巴凝結(jié)可預(yù)先將取血昆蟲或玻璃器皿冷卻或使血淋巴直接溶于含有檸檬酸鹽、EDTA（

57、乙二胺四乙酸）的生理鹽水中。 防止變黑由于血淋巴中豐富的多酚氧化E，當暴露于空氣中時， 容易黑化，產(chǎn)生黑色沉淀?？稍谘馨椭谢蚓彌_液中加入少量苯基 硫脲結(jié)晶（Phenyelthiourea）。 除去血細胞 2000-3000低速離心即可。毛細管定量取血法身體很小，血淋巴含量只有幾微升到十幾微升的昆蟲如瓢蟲、家蠅、蚜蟲、蚊等，要精確取到一定量的血淋巴可采用此法。毛細管經(jīng)清洗后浸于含苯基硫脲的水溶液中，然后烤干備用。取血方法：切斷觸角，翅基、足基部等，血淋巴溢出成小水珠狀，用小鑷子夾一定量毛細管對準小珠使其滲入毛細管，投入緩沖液中輕輕振蕩，經(jīng)離心后 即成稀釋液。反射流血取血法：當昆蟲受到一定的機械

58、或熱刺激時，從足關(guān)節(jié)、翅基部等部位特異的分泌血淋巴的現(xiàn)象稱反射流血。利用這一特點可對實驗昆蟲進行定量取血，既不損傷蟲體又可對一個個體進行系統(tǒng)的觀察分析。 血淋巴體積測定直接測定法（排空法或重量差別法）準確稱量蟲體鮮重剖開蟲體，流盡血淋巴濾紙吸干稱尸重重量差數(shù)再除血淋巴比重=血淋巴含量。該法簡單易行，不需要儀器設(shè)備，但誤差較大，往往偏低。 稀釋法先給蟲體注入一定體積一定濃度的被稀釋物，經(jīng)一定時間后再測定血淋巴中該物質(zhì)的濃度，根據(jù)被稀釋的倍數(shù)來推算血淋巴的體積。常用的稀釋法有： 血細胞稀釋法 顏料稀釋法（適用于血淋巴色素淺和體積較大蟲，常用莧菜紅） 同位素稀釋法（最方便、快速、靈敏、精確，可用3H

59、或14C菊粉）二、昆蟲電生理學實驗研究法電生理學研究活體中發(fā)生的電現(xiàn)象和電流對于活體的作用，主要研究神經(jīng)系統(tǒng)和感覺器官的電活動，如：昆蟲觸覺、聽覺、視覺、和化學感覺等中央神經(jīng)系統(tǒng)的自發(fā)性電活動化學藥劑對突觸傳導(dǎo)作用的影響各種離子對神經(jīng)傳導(dǎo)的影響神經(jīng)活動與內(nèi)分泌之間的關(guān)系等 昆蟲電生理學是以電子儀器為工具研究昆蟲機體活動時所產(chǎn)生的電現(xiàn)象，以深入研究和闡明生命 活動規(guī)律。（一）昆蟲電生理學常用實驗儀器1、生物電放大器 又稱前置放大器，用以放大生物電信號。 由于昆蟲個體小，電變化很微弱，通常僅為微伏（V）級或毫伏（mV）級。因此要觀察和記錄這種變化，必須將其放大才能在示波器或記錄儀器上顯示。2、電子

60、刺激器（和電極）研究昆蟲細胞、組織的電活動，需要通過刺激來誘發(fā)，電刺激是較為適宜與常用的方法。由于電刺激不易損傷組織，能定量、準確地重復(fù)應(yīng)用，。目前普遍應(yīng)用矩形波電子刺激器3、陰極射線示波器隨著電子計算機的廣泛應(yīng)用，微型計算機系統(tǒng)已成為現(xiàn)代電生理學中不可缺少的有用工具。通過模一數(shù)轉(zhuǎn)換器將放大后的生物電信號顯示于監(jiān)示器上，存貯于軟盤或普通錄音機磁帶上，也可用打印機打印文字或繪圖，同時可以進行數(shù)據(jù)處理和數(shù)值計算。 新概念電生理儀器： 生物電放大器 微操縱器 顯微鏡和微機系統(tǒng) 微操縱器 在解剖鏡監(jiān)視下，微操縱器夾持微電極，利用微操縱器的三維調(diào)節(jié)，尋找標本預(yù)計部位或細胞，引導(dǎo)電位。有：機械式和液壓式兩