電泳影響因素

1、在電泳過程中，帶電粒子的移動速度v除與粒子所帶電荷量Q及電場強(qiáng)度X有關(guān)外，還與 粒子半徑r及介質(zhì)的粘度n有關(guān)：v=QX/6nrn上式中，6n是適用于球形帶電粒子的經(jīng)驗(yàn)數(shù)值，對橢圓形或半徑很大的粒子則數(shù)值有所不 同?？梢?，帶電粒子的移動速度和粒子的本身的性質(zhì)有密切關(guān)系，粒子表面所帶電荷量和物 質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。此外，粒子的大?。ǚ肿恿浚┘傲Ｗ拥男螤畹纫灿兄匾挠绊?。 所以，在一定電場強(qiáng)度下，不同種類的帶電物質(zhì)在電泳時的移動速度就不能完全一致，這種 移動速度的差異就是電泳技術(shù)的基本依據(jù)。樣品帶電化合物的性質(zhì)在幾個方面影響著它們的遷移率。（1）電荷：遷移率隨凈電荷的增加而增加。電荷的大小一般由

2、pH決定。（2）分子大?。簩τ谳^大的分子，由于周圍介質(zhì)所引起的摩擦力和靜電力的增加，遷移率 下降。（3）形狀：同樣大小的，但是具有不同形狀的分子，如纖維狀的蛋白質(zhì)和球狀蛋白質(zhì)，因 摩擦力作用不同，而表現(xiàn)有不同的遷移特征。電場歐姆定律表示了電流A （安培）、電壓V （伏特）和電阻Q （歐姆）之間的關(guān)系：A=V/Q。 因此，離子在電場中的分離受到這三個因素的影響。（1）電流：由于在二個電極之間溶液中的電流完全由緩沖液和樣品的離子來傳導(dǎo)，因此， 遷移率與電流成正比。離子遷移的距離與通電時間成正比。因此，為了得到最好的重復(fù)性， 在電泳時電流必須保持恒定。當(dāng)然必須使用直流電。（2）電壓：電壓控制著電流，

3、因此，遷移率與加在支持介質(zhì)兩端的電位差成正比。這是電 壓梯度，一般用伏特/厘米（V/cm）來表示（即，所加的電壓除以支持介質(zhì)的長度）。可 以使用低電壓（100 500伏），或者高電壓（50010,000伏），電壓梯度分別可達(dá) 20和200伏/厘米。高電壓主要是用于分離小分子的化合物。（3）電阻：遷移率與電阻成反比，電阻由支持介質(zhì)的類型和大小，以及緩沖液的離子強(qiáng)度 所決定。電阻隨支持介質(zhì)的長度而增加，隨支持介質(zhì)的寬度和緩沖液離子強(qiáng)度的增加而降低。 在電泳時以A2Q瓦特的比率產(chǎn)生熱，并且電阻隨溫度升高而下降。因此，如果電壓保持不 變，那么這種溫度的升高將會引起電流的升高，并且促使了支持介質(zhì)上溶劑的

4、蒸發(fā)。為了盡 可能得到可重復(fù)的結(jié)果，使用經(jīng)過穩(wěn)定的電源裝置，盡管由于溫度的波動，不可避免地會引 起電阻的改變，但是這種電源能自動地保持電壓或者電流的恒定。用一個密閉的蓋子罩住電 泳槽以減少蒸發(fā)。在電泳槽中附設(shè)一個冷卻系統(tǒng)，在高壓工作時起到外加冷卻的作用。緩沖液緩沖液決定著并穩(wěn)定著支持介質(zhì)的pH，并且通過很多途徑也影響著化合物的遷移率。（1）成分：通常所用的緩沖液是甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、巴比妥鹽和磷酸鹽、Tris、 EDTA和此啶。硼酸緩沖液經(jīng)常用于碳水化合物的分離，因?yàn)樗鼈兡芎吞妓衔锂a(chǎn)生帶電 的復(fù)合物。因?yàn)榫彌_液是樣品的溶劑，因此，不可避免的會有一定強(qiáng)度的樣品擴(kuò)散。特別值得注意的是 像

5、氨基酸和糖一類的小分子。讓樣品走成很窄的帶，避免過量的加樣；在一個盡可能短的時間內(nèi)使用高電壓；以及在分離完成后迅速地取出并干燥等都能縮小擴(kuò)散的適度。濃度：由于緩沖液離子強(qiáng)度的增加，緩沖液所載的分電流也隨之增加，樣品所載的電 流則降低，因此而減緩了樣品的遷移率。增加緩沖液的離子強(qiáng)度也增加了總電流，因而增加 了熱的產(chǎn)生。在低離子強(qiáng)度時，緩沖液所載的電流下降，樣品所載的電流增加，因此加速了樣品的遷移。 低離子強(qiáng)度的緩沖液降低了總電流，結(jié)果減少了熱的產(chǎn)生，但是擴(kuò)散較嚴(yán)重，使分辨力明顯 的降低。所以，選擇離子強(qiáng)度時必須兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.020.2之間。離子 強(qiáng)度= CZ21Z2，C是

6、離子的克分子濃度，Z是它所帶的電荷。pH：像無機(jī)鹽那樣的完全離子化的化合物，pH的作用不大。但是對于有機(jī)化合物， pH決定了它的電離程度。有機(jī)酸的電離隨pH的增加而增加，有機(jī)堿則相反；因此，它們 的遷移程度由pH決定。對于像氨基酸一類既有堿性也有酸性的化合物(兩性電解質(zhì))，兩 種作用都有。因此，兩性電介質(zhì)遷移的方向以及遷移的程度由pH決定，根據(jù)分離的需要可以使用pH從 1-11范圍內(nèi)的緩沖液。在兩個蓄水槽中的緩沖液一般是相同的，用來飽和支持介質(zhì)，但是，在凝膠電泳中，緩沖液 是支持介質(zhì)的一部分，因此，在凝膠中經(jīng)常使用一種與緩沖液槽中不相同的緩沖液。這樣能 使電泳得到很好的分辨率。4.支持介質(zhì)雖然

7、使用了比較惰性的材料作為支持介質(zhì)，但是介質(zhì)的精確結(jié)構(gòu)對一種化合物的遷移率有很 多影響，而對介質(zhì)的選擇取決于所用的樣品類型。吸附：正如吸附層析一樣，這是支持介質(zhì)對樣品分子的滯留作用。它導(dǎo)致了樣品的拖尾，使樣品的 移動像一個彗星，不能形成一條很清晰的帶，因而降低了分離的分辨率。吸附也降低了總的 遷移率。紙的吸附最大，但使用醋酸纖維素實(shí)際上可以消除這種作用。電滲(電內(nèi)滲)：這種現(xiàn)象是由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間所產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷引起的。由于支 持介質(zhì)中基團(tuán)的電離作用以及對緩沖液離子的表面吸附作用，通常由水分子產(chǎn)生水合氫離子 (H3O+)。由于這些離子是帶正電荷的。因此它們帶著溶解的中性物質(zhì)移向陰極，加速 了陽離子的前進(jìn)、而阻滯了陰離子的移動。這種作用一般可以忽略不計(jì)，但是，如果在測定 化合物的等電點(diǎn)時，這種作用必須被考慮，一般通過對一種中性的分子(如脲或葡萄糖)進(jìn) 行電泳，測定它們遷移的程度來決定。醋酸纖維素或聚丙烯酰胺凝膠的電滲作用沒有紙或淀 粉膠那么明顯。分子篩：這是凝膠電泳的一個特性。在這種電泳中，半剛性支持介質(zhì)(凝膠)的分子篩特性有助于蛋 白質(zhì)一類不但在電泳移動率方面有所區(qū)別，而且在大小、形狀上也有所不同的大的離子化合 物的分離。凝膠是由分布于整個凝膠的自由纏繞的分子鏈組成，這些分子鏈?zhǔn)鼓z成為 一種篩樣的結(jié)構(gòu)。凝膠的孔徑可以在一定