呼吸道病毒7項(xiàng)檢測(cè)試劑

1、. - - - 可修編-復(fù)星醫(yī)學(xué)科技開(kāi)展呼吸道病毒7項(xiàng)檢測(cè) 試劑2011-1-10. 呼吸道病毒7項(xiàng)檢測(cè)試劑目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc3174984311概述 PAGEREF _Toc317498431 h 1HYPERLINK l _Toc3174984322D3Ultra DFA試劑 PAGEREF _Toc317498432 h 2HYPERLINK l _Toc3174984332.1 D3Ultra DFA試劑規(guī)格 PAGEREF _Toc317498433 h 2HYPERLINK l _Toc3174984342.2 D3Ultra D

2、FA試劑用途 PAGEREF _Toc317498434 h 2HYPERLINK l _Toc3174984352.3 D3Ultra DFA試劑特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì) PAGEREF _Toc317498435 h 2HYPERLINK l _Toc3174984362.4 D3Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)操作步驟 PAGEREF _Toc317498436 h 3HYPERLINK l _Toc3174984372.5 D3Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀 PAGEREF _Toc317498437 h 4HYPERLINK l _Toc3174984383D3Ultra DFA試劑競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì) PAG

3、EREF _Toc317498438 h 5HYPERLINK l _Toc3174984393.1 檢驗(yàn)的特異性和靈敏度 PAGEREF _Toc317498439 h 5HYPERLINK l _Toc3174984403.2 市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng) PAGEREF _Toc317498440 h 5HYPERLINK l _Toc317498441附錄1 七種病毒檢測(cè)的臨床意義 PAGEREF _Toc317498441 h 7HYPERLINK l _Toc317498442附錄2 實(shí)驗(yàn)室所需設(shè)備清單試劑盒中不含 PAGEREF _Toc317498442 h 8HYPERLINK l _Toc31

4、7498443附錄3 進(jìn)口熒光顯微鏡參數(shù) PAGEREF _Toc317498443 h 9. - - - 可修編-1概述日常生活中，幾種常見(jiàn)的呼吸道病毒往往給人們的工作和生活帶來(lái)極大的不便，有些甚至威脅到人們的安康和生命。在醫(yī)院和急診室中，這些呼吸道病毒也常常是診斷和治療的難題。常見(jiàn)的呼吸道病毒包括：A型甲型流感病毒，B型乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒RSV，腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型和副流感病毒3型。在病毒檢測(cè)方法中，抗原檢測(cè)有其無(wú)法比較的優(yōu)勢(shì)：1. 可以用于病毒的早期診斷，這對(duì)治療非常重要；2. 快速、簡(jiǎn)便的診斷方法，短時(shí)間得出結(jié)果，節(jié)省實(shí)驗(yàn)室的勞動(dòng)力和本錢(qián)。DHI公司的D3U

5、ltra DFA試劑屬于抗原檢測(cè)中的直接免疫熒光法。該試劑可以同時(shí)篩查和鑒定出常見(jiàn)的7種呼吸道病毒。D3Ultra DFA試劑主要的測(cè)試對(duì)象為嬰幼兒和兒童，所以目標(biāo)客戶(hù)群體為：兒童醫(yī)院、婦幼保健院和有兒科的三甲醫(yī)院。2D3Ultra DFA試劑2.1 D3Ultra DFA試劑規(guī)格D3Ultra DFA試劑分為7項(xiàng)呼吸道病毒篩查試劑和7項(xiàng)呼吸道病毒鑒定試劑。檢測(cè)病毒種類(lèi)：A型甲型流感病毒，B型乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒RSV，腺病毒，1、2、3型副流感病毒。具體規(guī)格如下：篩查試劑：10 mL，可用于400次測(cè)試鑒定試劑：每項(xiàng)鑒定試劑2 mL * 7，可用于80次測(cè)試另外，每盒試劑中含有40*

6、濃縮洗液25 mL，固定液15 mL，正常鼠丙種球蛋白試劑10 mL用于陰性質(zhì)控，含有7種呼吸道病毒抗原的陽(yáng)性質(zhì)控板5塊。2.2 D3Ultra DFA試劑用途D3Ultra DFA試劑能對(duì)疑似呼吸道病毒感染的患者進(jìn)展快速的病毒篩查和鑒定。及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷對(duì)于病人的治療非常重要，這主要表達(dá)在以下幾點(diǎn)：1、病毒治療針對(duì)性強(qiáng)金剛烷乙胺、瑞樂(lè)沙、奧司他韋達(dá)菲等是抗流感病毒的特效藥。RSV和副流感病毒可以使用利巴韋林和免疫球蛋白進(jìn)展治療。目前沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的抗腺病毒藥物，主要采取支持療法。2、病毒治療有時(shí)效性大局部呼吸道病毒越早治療效果越好。比方，奧司他韋在體的活性形式是一種強(qiáng)效的高選擇性的流感病毒NA抑制

7、劑，它主要通過(guò)干擾病毒從被感染的宿主細(xì)胞中釋放，從而減少甲型或乙型流感病毒的傳播。因此，在出現(xiàn)流感病癥的48小時(shí)使用奧司他韋才有用，過(guò)了這個(gè)時(shí)間段后療效甚微。3、防止抗生素的濫用病毒不同于細(xì)菌、衣原體、支原體等原核生物，其對(duì)抗生素不敏感，不能使用抗生素進(jìn)展治療。準(zhǔn)確的診斷能幫助醫(yī)生確定是否使用抗生素來(lái)治療病人。2.3 D3Ultra DFA試劑特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)1、產(chǎn)品幾乎覆蓋了所有常見(jiàn)呼吸道病毒的診斷2、采用直接免疫熒光法，較其他檢測(cè)方法有較大優(yōu)勢(shì)詳見(jiàn)表一3、實(shí)驗(yàn)步驟較簡(jiǎn)便，在短時(shí)間能得出結(jié)果，從而幫助醫(yī)生更好地治療病人4、使用質(zhì)量?jī)?yōu)異的抗體，染色步驟僅需15分鐘，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)室的勞動(dòng)力和本錢(qián)，同

8、時(shí)提高了臨床診斷的成功率，減少重復(fù)實(shí)驗(yàn)5、可以監(jiān)控感染的大規(guī)模流行6、擁有強(qiáng)大的科研團(tuán)隊(duì)，不斷研制和改良單克隆抗體表1、幾種常用檢測(cè)方法的比較檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)病毒別離培養(yǎng)特異性高耗時(shí)耗力，靈敏度較低抗原檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法較快速、簡(jiǎn)便有非特異性反響間接免疫熒光法較快速有非特異性反響直接免疫熒光法D3Ultra DFA試劑快速、簡(jiǎn)便，靈敏度和特異性均較高需要使用熒光顯微鏡血清學(xué)檢測(cè)快速、特異性較高對(duì)疾病初期診斷沒(méi)有太大幫助分子生物學(xué)方法較快速，靈敏度和特異性均較高操作繁瑣，價(jià)格昂貴2.4 D3Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)操作步驟1、樣品準(zhǔn)備步驟：將樣本充分震蕩混勻約10-15秒。在400-600*g

9、轉(zhuǎn)速下離心5-10分鐘。棄上清如果預(yù)留上清可用于細(xì)胞培養(yǎng)。在沉淀中加5 mL PBS緩沖液請(qǐng)使用普通PBS，不要使用試劑盒配套的濃縮洗液，充分震蕩混勻約10-15秒。在400-600*g轉(zhuǎn)速下離心5-10分鐘。吸走上清和黏液層，小心不要吸到沉淀。重復(fù)步驟4到6，直至黏液層被完全去除。注意：一定要將黏液去除干凈，否則會(huì)造成非特異熒光從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在沉淀中加0.5到1 mL的PBS緩沖液。用移液器反復(fù)吹吸來(lái)重懸細(xì)胞沉淀，形成一個(gè)略混濁的懸液。這個(gè)懸濁液可用于直接樣本測(cè)試。2、直接樣本測(cè)試步驟：在2孔或8孔板上的每孔滴加25 L的細(xì)胞懸濁液。樣本完全風(fēng)干。在20C到25C，用預(yù)冷的100%丙酮固

10、定細(xì)胞約5到10分鐘。注意：丙酮是易揮發(fā)、可燃性物質(zhì)，使用時(shí)請(qǐng)遠(yuǎn)離明火。從丙酮中取出載玻片并風(fēng)干。在固定并風(fēng)干的細(xì)胞上滴加一滴DFA染色試劑如圖1，使其完全覆蓋細(xì)胞注意：2孔或8孔板上有一孔是陰性對(duì)照孔，請(qǐng)勿滴加DFA染色試劑。在呼吸道病毒抗原對(duì)照板的每孔也要滴加DFA染色試劑。抗原對(duì)照板包含了被病毒感染的細(xì)胞和未感染的細(xì)胞，只能一次性使用。在陰性對(duì)照孔滴加正常鼠丙種球蛋白試劑，使其完全覆蓋細(xì)胞。將載玻片放于35C到37C的恒溫箱孵育15到30分鐘，為保持其濕潤(rùn)最好放置于帶蓋的盒子。用事先稀釋好的洗液漂洗染色細(xì)胞。為了更有效地洗滌，請(qǐng)將玻片在洗液中反復(fù)浸蘸4次左右。使用新的1*洗液再洗一次。用

11、去離子水再洗一遍。圖1、在玻璃板上滴加D3Ultra DFA染色試劑3、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果滴加2到3滴固定液，并加蓋蓋玻片20*50 mm，要注意防止產(chǎn)生氣泡。在200倍放大熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。2.5 D3Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀帶FITC標(biāo)記的抗體在熒光顯微鏡下會(huì)呈現(xiàn)明亮的綠色，如果細(xì)胞外表存在病毒抗原，染色后就會(huì)顯綠色。在熒光顯微鏡下，感染不同病毒的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)獨(dú)有的特征如圖2。圖2、顯微鏡下觀察染色細(xì)胞注：根據(jù)不同熒光顯微鏡，背風(fēng)光不一定為紅色3D3Ultra DFA試劑競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)3.1 檢驗(yàn)的特異性和靈敏度檢驗(yàn)的特異性: 用D3Ultra DFA 呼吸道病毒篩查和鑒定試劑對(duì)多種細(xì)胞和

12、微生物進(jìn)展穿插反響測(cè)試。對(duì)64種病毒、18種細(xì)胞、19種細(xì)菌均沒(méi)有穿插反響。檢驗(yàn)的靈敏度：熒光標(biāo)記的單克隆抗體平均能檢測(cè)出病毒的最低濃度約為1.0 PFU。3.2 市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)主要競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手為西班牙Vircell公司的9項(xiàng)呼吸道產(chǎn)品。D3Ultra DFA試劑與其主要有兩點(diǎn)不同：1. 檢測(cè)工程不同；2. 檢測(cè)原理不同1、Vircell產(chǎn)品檢測(cè)工程除了以上7種病毒外，還包含肺炎衣原體、支原體等原核生物檢測(cè)工程。但是，90%的感冒是由病毒引起的。如果是細(xì)菌、衣原體、支原體等感染，一般白細(xì)胞和C-反響蛋白CRP都會(huì)顯著升高，而病毒感染，這兩項(xiàng)指標(biāo)一般不會(huì)升高。我們建議醫(yī)生可以先做血常規(guī)或者CRP檢測(cè)，這樣

13、就能區(qū)分是病毒還是細(xì)菌感染，而這兩項(xiàng)測(cè)試不僅快速一般20-30分鐘，而且價(jià)格相對(duì)廉價(jià)。2、D3Ultra DFA試劑的檢測(cè)原理是用熒光FITC標(biāo)記的單克隆抗體檢測(cè)病毒抗原，屬于直接熒光免疫法。Vircell產(chǎn)品的檢測(cè)原理是用抗原檢測(cè)抗體IgM，使用的方法是間接免疫熒光法。雖然檢測(cè)IgM能區(qū)分出是既往感染還是急性感染，但是抗體產(chǎn)生的個(gè)體差異較大，特別是1歲以下的嬰幼兒和有免疫缺陷的人群，其抗體往往產(chǎn)生較慢。短時(shí)間，在體抗體缺乏的情況下，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性，從而錯(cuò)過(guò)了治療的最正確時(shí)期。甲型流感病毒其外表抗原變異較快，而人體往往不能及時(shí)產(chǎn)生針對(duì)新毒株的抗體，這時(shí)也會(huì)造成假陰性。間接免疫熒光法會(huì)增加非特

14、異性反響的幾率。表2、Vircell與D3Ultra DFA試劑比照VircellD3Ultra DFA檢測(cè)工程9項(xiàng)呼吸道病原體，其中包含在我國(guó)發(fā)病率很低的Q熱立克次氏體只檢測(cè)呼吸道病毒，降低患者的看病本錢(qián)，患者更易承受檢測(cè)原理需要體產(chǎn)生抗體后才能檢測(cè)出病原體，如果抗體產(chǎn)生較慢或者無(wú)抗體產(chǎn)生會(huì)有假陰性只要有病原體存在即可檢測(cè)，可在發(fā)病早期進(jìn)展快速診斷臨床意義*作為回憶性診斷，對(duì)病例的早期診斷意義不大可用于疾病早期診斷，對(duì)患者的治療有重大意義檢測(cè)靈敏度不能很好地檢測(cè)變異的病毒將多種抗體進(jìn)展組合，能更好地應(yīng)對(duì)變異的病毒，在多項(xiàng)檢測(cè)工程中靈敏度到達(dá)100%檢測(cè)方法間接免疫熒光法，二抗的使用會(huì)增加非特

15、異性反響直接免疫熒光法，特異性提高實(shí)驗(yàn)步驟二抗的使用讓實(shí)驗(yàn)步驟變得較為繁瑣一步染色，不易穿插污染*備注：引用自“流行性感冒診斷與治療指南2011年版“附錄1 七種病毒檢測(cè)的臨床意義流感病毒侵入呼吸道，經(jīng)1-2天的潛伏期，感染者即可出現(xiàn)流感病癥。病毒在上皮細(xì)胞復(fù)制，很少入血，但可釋放毒素樣物質(zhì)入血，引起全身中毒病癥：發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、疲乏無(wú)力、白細(xì)胞數(shù)下降等。幼兒或年老體弱病人感染流感病毒易繼發(fā)細(xì)菌感染，如合并肺炎等，病死率高。嬰幼兒特別是2-6個(gè)月的嬰兒對(duì)RSV特別敏感，常引起較為嚴(yán)重的呼吸道疾病，如細(xì)支氣管炎、肺炎等，患兒常出現(xiàn)呼吸暫停，氣管或細(xì)支氣管壞死物與粘液、纖維蛋白等結(jié)集在一起，

16、極易阻塞患兒的呼吸道，嚴(yán)重者造成死亡。在我國(guó)RSV還是引發(fā)流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起嬰幼兒尤其是新生兒較高的死率。腺病毒主要引起呼吸道感染，病癥有急性發(fā)燒、咽炎、扁桃體炎等。腺病毒肺炎約占兒童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；嬰幼兒腺病毒肺炎的病死率為8%-10%。除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性結(jié)膜炎、急性濾泡性結(jié)膜炎等。腺病毒與嬰幼兒胃腸道疾病也有可能相關(guān)，包括闌尾炎、急性胃腸炎，有時(shí)可引起腦炎和腦膜炎、出血性膀胱炎等。副流感病毒是引起小兒急性呼吸道感染的常見(jiàn)病因，僅次于RSV。副流感1、2型是哮喘的主要病因，以2-4歲兒童中最為嚴(yán)重。副流感3型

17、，亦可引起哮喘，但主要易引起嬰幼兒支氣管炎、肺炎，并以1歲以的嬰兒較為嚴(yán)重。病毒及其對(duì)應(yīng)抗病毒藥病毒種類(lèi)抗病毒藥物流感病毒金剛烷乙胺、瑞樂(lè)沙、奧司他韋達(dá)菲呼吸道合胞病毒利巴韋林噴霧劑副流感病毒病情嚴(yán)重者可使用利巴韋林腺病毒沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的抗病毒藥物，主要采取支持療法附錄2 實(shí)驗(yàn)室所需設(shè)備清單試劑盒中不含此列表中的器材和試劑是實(shí)驗(yàn)所必需的，但是未包含在試劑盒中，需要單獨(dú)購(gòu)置。器材和試劑規(guī)格1鼻咽拭子建議使用DHI配套鼻咽拭子2載玻片約70 mm * 20 mm 3蓋玻片約50 mm * 20 mm4生物平安柜2級(jí)5恒溫培養(yǎng)箱35C-37C6離心機(jī)管式7熒光顯微鏡可以看FITC490/520 nm，總200倍光學(xué)變焦8燒杯多種，用于洗玻片9量筒1 L配置洗液10帶蓋瓶1 L儲(chǔ)存稀釋洗液11加樣槍和槍頭