生物催化和轉(zhuǎn)化應(yīng)用實例

1、關(guān)于生物催化與轉(zhuǎn)化的應(yīng)用實例第一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月D-泛解酸內(nèi)酯是D-泛酸鈣與D-泛醇的重要手性中間體。 OHOO第二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月維生素藥物D-泛酸和D-泛醇 D-泛酸，Pantothenic acid，又稱遍多酸、維生素B5、或B3，是構(gòu)成輔酶A的成分，它是一種重要的藥物、食品添加劑和飼料添加劑。產(chǎn)品一般為其鈣鹽D-泛酸鈣（Calcium Pantothenate）。 D-泛醇（D-panthenol），又稱維生素原B5，是以液體形式存在的D-泛酸鈣的同效物，D-泛醇進入人體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為泛酸，進而合成輔酶A，促進人體蛋白質(zhì)、脂肪、糖類的代謝

2、，保護皮膚和粘膜，改善毛發(fā)光澤，防止疾病的發(fā)生。因此，D-泛醇作為營養(yǎng)補劑，特別適用于醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)。第三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.1 D-泛解酸內(nèi)酯的生物制備方法1.1.1 不對稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯 以近平滑假絲酵母Candida parapsilosis及小紅酵母Rhodotorula minuta為催化劑，葡萄糖作為能源，進行還原反應(yīng)，在28，pH46下反應(yīng)兩天，還原率達到100%，反應(yīng)液中產(chǎn)品D-泛解酸內(nèi)酯的濃度達到5090 g/L，光學(xué)純度達到94%98%e.e.。 第四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.1.2 不對稱還原酮基泛解酸 與以前面的

3、酮基泛解酸內(nèi)酯還原方法相比較，酮基泛解酸還原方法具有以下優(yōu)點：酮基泛解酸還原酶的產(chǎn)生菌都屬于Agrobacterium屬，而許多屬的微生物具有酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶的活性。酮基泛解酸還原酶的光學(xué)選擇性很高（98% e.e.以上），而酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶的光學(xué)選擇性與產(chǎn)生該酶的微生物所在屬或者種無關(guān)。這些結(jié)果表明催化酮基泛解酸還原的酶為單一酶（可能是酮基泛解酸還原酶），而酮基泛解酸內(nèi)酯的還原酶可能是多種具有不同光學(xué)選擇性的還原酶共同作用的。 第五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.1.3 不對稱氧化和還原兩步酶法轉(zhuǎn)化消旋泛解酸內(nèi)酯 Nocardia asteroides可以不對稱氧化DL

4、-泛解酸內(nèi)酯中的L-型成酮基泛解酸內(nèi)酯，酮基泛解酸內(nèi)酯又可以由Candida parapsilosis不對稱還原成D-泛解酸內(nèi)酯。在這個兩步酶催化反應(yīng)體系中，D-型的泛解酸內(nèi)酯始終沒有被修飾，而是L-型的泛解酸內(nèi)酯經(jīng)過兩步微生物酶催化，最終變成了D-型。 第六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月OHOO 可以用來代替Candida parapsilosis，與Nocardia asteroides共同進行反應(yīng)，它可以在酮基泛解酸內(nèi)酯自發(fā)水解為酮基泛解酸后，將其不對稱還原成D-泛解酸，D-泛解酸再酯化得到D-泛解酸內(nèi)酯。這一系列反應(yīng)用洗滌過的細胞可在同一生物反應(yīng)器內(nèi)一步轉(zhuǎn)化完成。 第七張，

5、PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月OOOHOHOHCOOHOOOH+內(nèi)酯化，消旋化DL-PLL-PAD-PL 用L-立體專一性內(nèi)酯水解酶水解，將L-泛解酸內(nèi)酯水解為L-泛解酸，可直接得到未水解的D-泛解酸內(nèi)酯。L-泛解酸可以回收，經(jīng)過消旋化反應(yīng)得到DL-泛解酸內(nèi)酯重新用于拆分。 第八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月+消旋化OOOHDL-PLOOOHL-PLOHOHCOOHD-PAOOOHD-PL內(nèi)酯化 用鐮孢霉菌Fusarium等微生物選擇性水解DL-泛解酸內(nèi)酯生成D-泛解酸，分離后的D-泛解酸在酸性條件下加熱，轉(zhuǎn)化為D-泛解酸內(nèi)酯。 第九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6

6、月 D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliformeSW-902，用于發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體作酶源，水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯，分離得到D-泛解酸，再經(jīng)過內(nèi)酯化反應(yīng)，可得到很高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯。該方法不要求水解徹底，反應(yīng)時間短，得到產(chǎn)品D-泛解酸內(nèi)酯的光學(xué)純度高，工藝控制簡單，反應(yīng)容易控制，底物的濃度可以很高。此項技術(shù)已在浙江鑫富生化公司實施產(chǎn)業(yè)化。異丁醛等D-泛酸鈣D-泛醇內(nèi)酯水解酶1.2 工業(yè)化水解酶制備D-泛解酸內(nèi)酯介紹第十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月D-泛解酸內(nèi)酯的酶法拆分工藝流程L-泛解酸內(nèi)酯DL-泛解酸內(nèi)酯異丁醛，甲醛，HCN

7、消旋化反應(yīng)D-泛解酸微生物酶D-泛解酸內(nèi)酯內(nèi)酯化反應(yīng)orD-泛酸鈣D-泛醇第十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用例2微生物法制備抗抑郁藥R-托莫西汀中間體的研究第十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 研究意義 具有特定功能基團的手性醇是用于合成手性藥物和其他手性化學(xué)品重要的中間體。3-氯-1-苯丙醇是一種重要的手性藥物中間體。光學(xué)純的3-氯-1-苯丙醇可用于制備S-(+)-氟西汀，R-(-)-托莫西汀，()-尼索西汀。S-(+)-氟西汀是R-(+)-氟西汀藥效的3倍；R-(-)-托莫西汀是消旋體托莫西汀藥效的2倍，是S-(-)-托莫西汀藥效的9倍。以上三種藥物均為

8、抗抑郁藥，可通過下圖制備。第十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月由3-氯-1-苯丙醇制備手性抗憂郁藥 第十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 菌種的篩選 菌種Saccharomyces P2Saccharomyces B5Candida 104Candida 1257產(chǎn)率(%)305048100光學(xué)純度( ee%)7410010033*第十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月標準品的GC分析圖譜 A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），B：S-3-氯-1-苯丙醇（42.613min）第十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Saccharomyce

9、s B5還原底物的GC圖譜A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），C: R-3-氯-1-苯丙醇(44.022min)min303234363840424446pA93.594.595.596.597.5CA第十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月以乙醇為共底物有助于輔酶再生的機理 第十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月微生物的培養(yǎng)條件及反應(yīng)條件對還原反應(yīng)的影響 strains Reaction conditionAnoxybiotic cultureOxybiotic cultureYield(%)ee(%)yield(%)ee(%)shaking0/50100stan

10、ding0/28100 Candida 104shaking0/48100standing0/26100Saccharo-myces B5 第十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月還原反應(yīng)中微生物的重復(fù)利用重復(fù)利用次數(shù)Saccharomyces B5Candida 104yield(%)ee(%)yield(%)ee(%)1511004810025010048100350100471004371000/50/0/第二十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月S- -氰基-3-苯氧基芐醇(S-CPBA )的合成與應(yīng)用應(yīng)用例3第二十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3-苯氧基苯

11、甲醛（mPBA）的不對稱羥氰化反應(yīng) 手性金屬復(fù)合物 生物堿催化 多肽催化 醇腈酶（Oxynitrilases）或醇氰裂解酶（hydroxynitrile lyases） 催化劑:3.1 拆分制備S-CPBA的過程第二十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月S-醇腈酶催化拆分合成S-CPBA 脂肪酶催化選擇性水解合成S-CPBA 第二十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶催化不對稱酯化拆分合成S-CPBA 酶催化不對稱醇解合成S-CPBA 第二十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月其中R為： 化學(xué)-酶催化一鍋化合成S-CPBA 第二十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于202

12、2年6月脂肪酶催化醇解反應(yīng)拆分（R，S）-CPBAc反應(yīng)式第二十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2 酶反應(yīng)體系的確定 酶反應(yīng)時間反應(yīng)溶劑底物醇S-CPBAmPBA(mmol/l)Yield%e.e.%2228hrTHF甲醇48.7499.168.97乙醇49.9899.057.68二氯甲烷甲醇35.5998.9530.34乙醇34.8799.1124.11乙醚甲醇50.1396.1317.22乙醇50.7797.6912.432430hrTHF甲醇49.6095.3720.58乙醇46.2296.1515.4氯仿甲醇20.4691.5762.65乙醇21.3892.7355.3

13、4甲苯甲醇26.5274.0297.88乙醇20.8775.1992.55第二十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月無溶劑體系酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)式 應(yīng)用例4第二十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用例 5 生物催化法制備手性2-芳基丙酸 第二十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5.1 2-芳基丙酸概述 2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(Non-Steroid Anti-Inflamming Drugs，NSAIDs)，是一類重要的消炎鎮(zhèn)痛藥，可用化學(xué)通式ArCH(CH3)COOH表示。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有解熱、消炎鎮(zhèn)痛作用的2-芳基丙酸類藥物有幾十種，大多數(shù)已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)。常

14、見的品種有：萘普生(Naproxen)、布洛芬(Ibuprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、酮基布洛芬(Ketoprofen)、舒洛芬(Suprofen)等等。以酮基布洛芬為例，其消炎鎮(zhèn)痛作用比阿司匹林強150倍，解熱作用強100倍，臨床上用于治療慢性類風濕關(guān)節(jié)炎、變形關(guān)節(jié)炎、外傷和術(shù)后疼痛。 第三十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶催化水解拆分芳基丙酸酯反應(yīng)示意圖脂肪(酯)酶或催化抗體 研究發(fā)現(xiàn)來源于根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和假絲酵母（Candida）屬的胞外脂肪酶均對不同的萘普生酯具有很高的立體

15、選擇性，且穩(wěn)定性和底物耐受性很高（1mol/L）。 5.2 酶法拆分工藝第三十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反應(yīng)示意圖 腈水解酶腈水合酶酰胺酶 其路線主要有兩條：一是用微生物腈水解酶(Nitrilase)直接立體選擇性水解拆分2-芳基丙腈為光學(xué)純的2-芳基丙酸；二是腈水合酶(Nitrile Hydratase)和酰胺酶(Amidase)相結(jié)合立體選擇性水解拆分2-芳基丙腈為光學(xué)純的2-芳基丙酸。第三十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶催化酯化酶催化酯化反應(yīng)拆分2-芳基丙酸反應(yīng)示意圖 來源于Candida rugosa、Rhizomuco

16、r miehei、Candida antarctica等的脂肪酶均可用于2-芳基丙酸酯化的拆分。如Novo公司的Lipozyme 1000L(來源于Rhizomucor miehei)用于催化(R,S)-布洛芬與辛醇的選擇性酯化反應(yīng)，優(yōu)先選擇(S)-構(gòu)型，對映選擇率(E)100;不過對于酮基布洛芬，優(yōu)先選擇(R)-構(gòu)型，而且E值僅有2.4。 第三十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶催化氧化微生物酶催化氧化芳基烷烴制備(S)-2-芳基丙酸示意圖酶催化氧化芳基丙醛制備(S)-布洛芬 微生物第三十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5.3 (R, S)-萘普生酶法拆分 非水相酶促

17、酯化拆分萘普生的技術(shù)路線 產(chǎn)品分離消旋非水介質(zhì)+ROH, Lipase水解S-萘普生第三十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶促選擇性水解萘普生酯的技術(shù)路線 第三十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5.4 布洛芬(ibuprofen)酶法拆分 +ROH, Lipase非水介質(zhì)產(chǎn)品分離水解消旋S-布洛芬非水相酶促酯化拆分布洛芬的技術(shù)路線 第三十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶促選擇性水解布洛芬酯的技術(shù)路線 第三十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 (S)-布洛芬的提取工藝 水解反應(yīng)液鹽酸酸化石油醚提取水相有機相丟棄5% NaOH溶液反應(yīng)水相有機相鹽

18、酸酸化石油醚提取水相有機相丟棄S(+)-布洛芬R(-)-布洛芬乙酯布洛芬消旋乙酯第四十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5.5 酮洛芬(Ketoprofen) 酶法拆分+ROH, Lipase產(chǎn)品分離水解消旋非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技術(shù)路線 第四十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月乙醇乙醇Novozym 4351,2-二氯丙烷總產(chǎn)率：60%Novozym 4351,2-二氯丙烷OCOOHOCOOEtOCOOHOCOOHOCOOHOCOOHOCOOR(+)-1, (500 g)(-)-2, ee 55% (322 g)(+)-1, ee 77% (209 g)(+)-1, (

19、209 g)(+)-1, ee 38% (418 g)(+)-1, ee 96% (209 g)(-)-2, ee 20% (232 g)大規(guī)模的制備（S）-酮基布洛芬 第四十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月OCOOHOCOOROCOOHOCOOROCOONaOCOOR+酯化lipase，水解分離有機相水相消旋化1234+酶促選擇性水解酮洛芬酯的技術(shù)路線 第四十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用例6L-苯丙氨酸的酶法制備 第四十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月6.1 L-苯丙氨酸的性質(zhì)用途 苯丙氨酸純品為白色粉末，有苦味，微溶于醇，不溶于苯，熔點283，比

20、旋光D25=34.4（c=1，H2O）。25時在水中溶解度是2.97g/100g。等電點為pH5.48。結(jié)構(gòu)式： L-苯丙氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，作為一種營養(yǎng)增補劑，是配制氨基酸輸液和制劑及氨基酸營養(yǎng)食品的主要成份，L-苯丙氨酸目前最大的用途是用于天苯二肽甜味劑的合成，其中阿斯巴甜的世界銷量為4萬噸/年。阿斯巴甜以安全、美味、低熱值、高甜度而成為優(yōu)秀的無糖甜味劑。 第四十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2 L-苯丙氨酸的酶法制備路線 苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶酶法 第四十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 肉桂酸酶法(苯丙氨酸解氨酶（PLA） ) 芐基海因酶法橫關(guān)健三等以

21、苯甲醛和海因為原料合成得到DL-芐基海因，在L-海因酶和N氨甲酰水解酶的作用下酶法水解得到L-苯丙氨酸，該路線的關(guān)鍵是前體芐基海因的低成本制備和高活性L-海因酶的篩選。 第四十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月苯丙酮酸脫氫酶法 以苯丙酮酸為前體，通過還原性氨化作用合成L-苯丙氨酸。1987年，Asano等人采用從自然界中分離到的尿素芽孢八疊球菌（Sporosurcina ureae）SCRC-R04所生產(chǎn)的高活性苯丙氨酸脫氫酶，與用于輔酶NADH再生的甲酸脫氫酶組成共軛反應(yīng)體系，L-苯丙氨酸產(chǎn)率達到116g/L，轉(zhuǎn)化率可以達到89%。工藝路線示意如下：第四十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)

22、作于2022年6月藥用氨基酸： L-色氨酸、 L-蛋氨酸等 1969年日本千鈾一郎首先在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；覆鸱諨L-氨基酸獲得成功。被稱為酶工程的開始。有些氨基酸發(fā)酵法很難，酶工程方法是目前推崇的方法第四十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生產(chǎn)L-苯丙氨酸 以苯丙酮酸和L-天門冬氨酸為原料，用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，生成 L-苯丙氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸脫羧生成丙酮酸和二氧化碳。反應(yīng)式右圖。 L-天冬氨酸 E.coli SW0209-31第五十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用例7酶法制備D-氨基酸 第五十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作

23、于2022年6月7.1 D-氨基酸的應(yīng)用 （1）多肽抗生素 短桿菌肽 A 第五十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月生長抑制素八肽類似物(oxtreotide)，用于治療VIP瘤、類癌綜合癥及胃泌素瘤等 醋酸奧曲肽(sandostatin acetate，商品名：善得定),用于治療肢端肥大癥、胰瘺、腫瘤激素性腹瀉的肽激素分泌失調(diào)、非腫瘤性腹瀉，治療胃切除后發(fā)生的腹瀉綜合癥。 第五十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 半合成抗生素 以D-HPG或D-PG為側(cè)鏈的半合成抗生素，因其肽鍵很難被-內(nèi)酰胺酶作用從而具有較高的穩(wěn)定性，而且具有抗菌譜廣、毒性小、過敏性低、吸收快、血濃度高、

24、藥力持續(xù)時間長、口服效果好等遠優(yōu)于青霉素G的藥理性能。第五十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 肽類甜味劑具有很高的商業(yè)價值。目前市售的天苯二肽（商品名阿斯巴甜，aspartame）是一種優(yōu)良的甜味劑，其甜度為蔗糖的200倍，適用于肥胖癥、糖尿病和心血管病人食用。但它不適合苯丙酮酸尿患者，并且對酸堿和溫度穩(wěn)定性差，限制了其在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。由D-Ala與L-Asp反應(yīng)合成得到的天丙二肽（商品名阿力甜，alitame），其甜度為蔗糖的2,000倍，且對熱和酸堿穩(wěn)定，可廣泛適用于食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)作甜味劑，具有極好的市場前景。1983年由Brennan T.M.獲得的阿力甜的美國專利，目前已在澳大