微生物學(xué)課件：4 細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感試驗(yàn)

1、細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感試驗(yàn)概念：細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱(chēng)藥敏試驗(yàn)）是測(cè)定某一菌株對(duì)某種抗菌藥物是敏感還是耐藥的一種體外監(jiān)測(cè)試驗(yàn)。因此，在使用抗菌藥物的過(guò)程中，必須加強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)，為臨床上合理使用抗菌藥物提供試驗(yàn)依據(jù)。而細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感試驗(yàn)，就是對(duì)抗菌藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)的主要手段之一。目的：1、為臨床上治療某個(gè)病人選擇最佳抗菌藥物，指導(dǎo)臨床用藥，避免由于用藥不當(dāng)，導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生或造成人體傷害.2、進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，了解致病菌的耐藥變遷情況，為醫(yī)療行政主管部門(mén)的決策提供依據(jù).3、用于某些細(xì)菌的鑒別和鑒定：如Optochin敏感試驗(yàn)、桿菌肽敏感試驗(yàn)和新生霉素敏感試驗(yàn)，

2、分別用于鑒定不同的細(xì)菌；4、評(píng)價(jià)新抗菌藥物的抗菌譜及抗菌活性等藥效學(xué)特性。二、 敏感和耐藥的概念一般認(rèn)為，某菌株能被某種抗菌藥物抑制或殺滅，則該菌株對(duì)該抗菌藥物敏感；反之，則為耐藥。上述概念雖然考慮到了細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，但卻忽略了藥物的劑量、濃度和機(jī)體的耐受性。若某抗菌藥物對(duì)某菌株的最小抑菌濃度（MIC）小于該抗菌藥物的治療濃度，則為“敏感”（S, Sensitive）；若某抗菌藥物對(duì)某菌株的最小抑菌濃度（MIC）大于該抗菌藥物的治療濃度，則為“耐藥”（R, Resistant）；若MIC介于治療濃度的上下限之間，則為“中介度”（I, Intermediate）。1、MIC（Minimu

3、m inhibitory concentration）所謂MIC，就是某抗菌藥物對(duì)某菌株的最小抑菌濃度。其測(cè)定方法是：（1）、取一列潔凈無(wú)菌的小試管，各管分別加營(yíng)養(yǎng)肉湯1ml；（2）、第一管加入含1280 U/ml的抗菌藥物原液1ml,后倍比稀釋至次末管后吸出1ml 棄去；（3）、各管分別加入試驗(yàn)菌液0.1ml;（4）、置37孵箱中培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：含最小藥物量仍呈明顯不混濁的一管所含的藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度（MIC）。 2、血藥濃度（血清中抗菌藥物的濃度）在使用各類(lèi)抗菌藥物時(shí)，常常會(huì)遇到的一個(gè)重要問(wèn)題，就是血藥濃度。例如：口服抗菌藥物總是經(jīng)腸道逐漸吸

4、收入血的。因此，血液中的藥物濃度是從無(wú)到有隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高的。即使靜脈注射抗菌藥物，因存在著首過(guò)效應(yīng)（第一關(guān)卡效應(yīng)）和腎臟的排泄作用，血藥濃度也是隨著注射的次數(shù)而逐漸增高的。3、血藥濃度與MIC之間的關(guān)系當(dāng)MIC小于血藥濃度中治療濃度的下限時(shí)，則稱(chēng)為“敏感”，用“S”（Sensitive）表示。當(dāng)MIC大于治療濃度的上限時(shí)，則為“耐藥”，用“R”（Resistant）表示。當(dāng)MIC介于治療濃度的上下限之間時(shí)，則為“中介度”，用“I”（Intermediate）表示。 但是藥物在局部組織和組織液中的濃度，往往只有血清濃度的1/21/10，故在治療局部組織感染時(shí)，僅僅以MIC小于血清治療濃度定

5、為敏感往往會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，應(yīng)該以MIC小于血清治療濃度的210倍，才是敏感。因此，在治療局部組織或組織液感染選用抗菌藥物時(shí)，一般治療劑量，至少應(yīng)該是抗菌藥物對(duì)病原菌的MIC的35倍。目前，臨床上選擇抗菌藥物，常根據(jù)抑菌商數(shù)來(lái)選擇。所謂“抑菌商數(shù)”（Inhibitory Quotient，簡(jiǎn)稱(chēng)IQ），是指某抗菌藥物在局部組織或體液中的濃度除以該藥物對(duì)感染菌的最小抑菌濃度所得的商數(shù)。即： 局部組織或體液中的藥物濃度 IQ = MIC抑菌商數(shù)越大，抑菌效果越明顯；反之，抑菌商數(shù)越小，抑菌效果越差。三、藥敏試驗(yàn)的方法、稀釋法所謂稀釋法是把培養(yǎng)基內(nèi)抗菌藥物的含量按幾何級(jí)數(shù)稀釋并接種適量的細(xì)菌，經(jīng)孵育后

6、，觀察能引起抑菌作用的抗菌藥物濃度（即MIC），從而確定被檢菌對(duì)某抗菌藥物的最低敏感度。稀釋法所獲結(jié)果比較準(zhǔn)確，常被用作校正其它方法的標(biāo)準(zhǔn)。但因操作繁雜，作為常規(guī)應(yīng)用尚有一定的困難。（一）、液體稀釋法（液體培養(yǎng)基試管稀釋法）【原理】所謂液體稀釋法就是以液體培養(yǎng)基將抗菌藥物做不同濃度的稀釋?zhuān)缓蠓N入待檢細(xì)菌，從而定量測(cè)定抗菌藥物對(duì)被檢菌的最小抑菌濃度（MIC）的方法?！驹囼?yàn)過(guò)程】1、 藥物原液的配制：常用的藥物溶劑有：蒸餾水、PBS緩沖液、乙醇、二甲基甲酰胺等。常用的稀釋液主要是蒸餾水。選擇溶劑和稀釋液的原則：、就簡(jiǎn)不就繁、就易不就難；、必須保證使藥物能發(fā)揮最大作用的 環(huán)境。2、液體培養(yǎng)基的選擇

7、：、葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌等一般細(xì)菌，可采用肉湯培養(yǎng)基或肉膏湯培養(yǎng)基；、鏈球菌、肺炎鏈球菌等營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌，一般采用0.5%羊紅細(xì)胞肉膏湯或含5%脫纖維羊血的肉湯；不宜在肉膏湯中加血清或腹水，因血清和腹水可能吸附藥物，而減低抗菌效果；、對(duì)具有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的細(xì)菌，應(yīng)盡可能選用能滿足其生長(zhǎng)需要的特殊培養(yǎng)基，如嗜血桿菌應(yīng)采用0.5%兔紅細(xì)胞肉膏湯；、無(wú)論是哪一種細(xì)菌，當(dāng)作細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用無(wú)蛋白胨肉湯，因磺胺類(lèi)藥物與蛋白胨的結(jié)合率極高，可影響測(cè)試結(jié)果。3、試驗(yàn)菌液的制備： 在進(jìn)行藥敏試驗(yàn)之前，應(yīng)首先將試驗(yàn)菌液準(zhǔn)備好，其方法是：取一接種環(huán)分純的被檢細(xì)菌，接種到1ml

8、上述相應(yīng)的肉湯培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)。由于不同的細(xì)菌分裂速度不一樣，故培養(yǎng)時(shí)間和菌液的濃度也因細(xì)菌的不同而異。 、葡萄球菌、腸桿菌科等一般細(xì)菌培養(yǎng)6h，菌液濃度相當(dāng)于9億/ml細(xì)菌，再用肉膏湯做1：1000稀釋備用；、鏈球菌、肺炎鏈球菌等細(xì)菌培養(yǎng)18h，菌液濃度相當(dāng)于3億/ml,再用0.5%羊紅細(xì)胞肉湯1：10稀釋備用。4、試驗(yàn)方法：、取無(wú)菌小試管若干支置于試管架上，再以無(wú)菌操作每管加相應(yīng)的液體培養(yǎng)基1.0ml；、無(wú)菌操作吸取抗菌藥物稀釋液1.0ml加入第一管，混勻后吸取1.0ml加入第二管；再混勻后吸取1.0ml加入第三管；如此做逐管倍比稀釋至次末管，混勻后吸取1.0ml棄去。最后一管不加抗

9、菌藥物作為空白對(duì)照；、每管加被檢菌液的稀釋液0.1ml，混勻后置3537孵箱中培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。5、結(jié)果判斷：肉眼觀察，含最小藥物量仍呈明顯不混濁的一管所含的抗菌藥物濃度即為MIC。 （二）、固體稀釋法（固體培養(yǎng)基平板法）【原理】將一組遞減濃度的抗菌藥物分別與定量的瓊脂培養(yǎng)基混合并分別傾倒平皿。接種待檢菌與其上，經(jīng)培養(yǎng)后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，含最低藥物濃度仍能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的平皿中的藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)被檢菌的最小抑菌濃度。 【試驗(yàn)過(guò)程】1、培養(yǎng)基配制：常用培養(yǎng)基是Mueller Hinton (M、H) 瓊脂。其配方如下：酪蛋白胨水解物 17.5g 可溶性淀粉 1.5g 瓊脂 17g

10、肉浸液 1000ml 調(diào)pH7.4，分裝試管或燒瓶，15磅15分鐘高壓 滅菌備用。 按上法配制Mueller Hinton (M、H) 瓊脂若干瓶，每瓶90ml,高壓滅菌后，置于50水浴箱中，使其恒溫后備用。2、抗菌藥物原液及稀釋液的制備先按各種抗菌藥物的性質(zhì)選用適宜的溶劑和稀釋液配制成藥物原液，其濃度分別為2000g(U)/ml、1280g(U)/ml、160g(U)/ml、20g(U)/ml，然后按下表制成稀釋液：3、 試驗(yàn)菌液的制備：具體方法見(jiàn)液體稀釋法。4、 實(shí)驗(yàn)方法、將上述抗菌藥物的各個(gè)濃度的稀釋液10ml,無(wú)菌操作分別加入裝有90ml且已恒溫至50的M、H瓊脂內(nèi)，混勻后，每瓶倒平皿

11、4個(gè)（9cm平皿，每個(gè)倒入25ml），待凝固后接種被檢細(xì)菌。 、以棉拭子取試驗(yàn)菌液，涂抹接種于上述一列平皿培養(yǎng)基上。、置3537孵箱中，培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。5、 結(jié)果判斷：含抗菌藥物最低的瓊脂平皿上不出現(xiàn)菌落者，其含藥濃度即為該藥對(duì)試驗(yàn)菌的MIC。固體培養(yǎng)基平板法藥敏試驗(yàn)，比液體稀釋法好，其優(yōu)點(diǎn)是：、比液體稀釋法重復(fù)性好；、每個(gè)平板可同時(shí)測(cè)定多株細(xì)菌；、可觀察被檢菌菌落生長(zhǎng)是否良好；、可發(fā)現(xiàn)污染細(xì)菌；、可引入機(jī)械化手段，提高效率。、擴(kuò)散法 所謂擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，即是將含有一定量抗菌藥物的紙片或藥片，平貼在已經(jīng)接種被檢細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)基上，含藥紙片或藥片中的抗菌藥物即向周?chē)鷶U(kuò)散，并在紙片周?chē)纬蓾舛戎饾u降低的濃度梯度。被檢菌株在紙片或藥片周?chē)囊欢ǖ乃幬餄舛确秶鷥?nèi)因生長(zhǎng)受到抑制而形成抑菌環(huán)，根據(jù)抑菌環(huán)的大小，即可判斷出被檢菌株對(duì)某種抗菌藥物的敏感性。 標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判讀表（三）、分界點(diǎn)的計(jì)算方法選取一大群同種不同株的細(xì)菌做藥敏試驗(yàn)（至少選取100株，包括敏感菌株和耐藥菌株），求出該群細(xì)菌中每一菌株對(duì)某抗菌藥物的MIC及其相應(yīng)的抑菌環(huán)直徑。因抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的MIC與其相應(yīng)的抑菌環(huán)直徑呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，據(jù)此可繪制回歸直線圖。方法如下：結(jié)果及意義 1）協(xié)同：（1）細(xì)菌對(duì)甲藥無(wú)效，乙藥抑菌環(huán)向甲藥擴(kuò)大