臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)：第四章 單克隆抗體和基因工程抗體的制備技術(shù)

1、1第四章 單克隆抗體和基因工程抗體的制備技術(shù)2抗體制備技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)的三個(gè)階段用純化抗原免疫動(dòng)物獲得的血清多克隆抗體(polyclonal antibody, PcAb)為第一代抗體。用B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)為第二代抗體。第三代為基因工程抗體(genetic engineering antibody)。上述抗體的制備方法與特點(diǎn)各不相同，本章將分別介紹。3單克隆抗體1975年Kohler和Milstein首先報(bào)道用細(xì)胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC)免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立起第一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，并成功地制得

2、抗SRBC的 單克隆抗體（monoclonal antibody,McAb)。McAb的理化性狀高度均一，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)。Kohler和Milstein于1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。4第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理基本原理： 雜交瘤技術(shù)是利用腫瘤細(xì)胞容易體外培養(yǎng)和長(zhǎng)期生存的特性，將分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，制備的雜交瘤細(xì)胞同時(shí)繼承了B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞兩者的性質(zhì)，既能分泌特異性抗體，又能長(zhǎng)期生存。這樣，就可以方便地用雜交瘤細(xì)胞制備和生產(chǎn)大量的單克隆抗體。5一、雜交瘤技術(shù)脾細(xì)胞 HGPRT+ Ig+骨髓瘤細(xì)胞HGPRTIgHAT培養(yǎng)基雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體McAb

3、Y Y Y Y Y6（一）親本細(xì)胞的選擇與融合 1致敏B細(xì)胞 2骨髓瘤細(xì)胞 3細(xì)胞融合 71致敏B細(xì)胞首先用抗原免疫BALB/C小鼠，使機(jī)體B細(xì)胞被激活成為具有分泌抗體能力的漿細(xì)胞。脾是B細(xì)胞聚集的重要場(chǎng)所，故致敏B細(xì)胞主要來源于脾臟。82小鼠骨髓瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞為B細(xì)胞系惡性腫瘤，能在體外 長(zhǎng)期增殖并容易與B細(xì)胞融合。9用于雜交瘤技術(shù)的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)符合的條件本身不分泌免疫球蛋白；為次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hypoxanthine-guanine- phospheribosyl-transfer ase，HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（thymidine- kinase，TK）缺陷的細(xì)胞

4、株；瘤細(xì)胞能與B細(xì)胞雜交形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞；與B細(xì)胞融合率高。10目前常用的骨髓瘤細(xì)胞株BALB/C小鼠骨髓瘤NS1細(xì)胞株SP2/0細(xì)胞株等。113細(xì)胞融合細(xì)胞融合（fusion）是制備單克隆抗體的中心環(huán)節(jié)。方法：物理方法（如電場(chǎng)誘導(dǎo)）、化學(xué)方法（如PEG）或生物學(xué)方法（如仙臺(tái)病毒）等。最常用的助融劑是分子量為10002000道爾頓的PEG。12(二) 雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的篩選： 兩種親本細(xì)胞經(jīng)PEG或其他方法處理后， 可融合成不同類型的融合體， 正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅57天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。 要從中篩選出

5、真正的雜交瘤細(xì)胞， 必須進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。目前，常用HAT培養(yǎng)基。 HAT培養(yǎng)基： H: hypoxanthine 次黃嘌呤 A: aminopterin 氨基蝶呤 T: thymidine 胸腺嘧啶脫氧核苷 13細(xì)胞合成DNA的途徑：1. 生物合成的主要途徑，即利用糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，而葉酸拮抗物氨基喋呤可阻斷該途徑。2. 另一途徑是應(yīng)急途徑，當(dāng)葉酸代謝受阻斷后，細(xì)胞通過次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶( HGPRT )和胸腺嘧啶核苷激酶( TK )，催化核苷酸前體合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。 根據(jù)以上原理研制常規(guī)篩選用的HAT選擇培養(yǎng)基，可對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。14細(xì)胞DNA生

6、物合成途徑示意圖糖+氨基酸 氨基喋呤(A) 次黃嘌呤(H) HMP 核苷酸 核苷酸前體 DNA TK 胸腺嘧啶(T) TMP HGPRT正常途徑應(yīng)急途徑15用來融合的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選擇出來的缺乏HGPRT的細(xì)胞株，所以在HAT選擇培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。只有雜交瘤細(xì)胞具有親代雙方的遺傳特性，即既有骨髓瘤細(xì)胞在體外無限繁殖的生命力又有B細(xì)胞經(jīng)輔助途徑合成DNA的能力，故可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活并繁殖。16有限稀釋與抗原特異性選擇有限稀釋法 是目前應(yīng)用最廣的一種克隆化方法。在動(dòng)物免疫中，應(yīng)選用高純度的抗原。一種抗原往往有多個(gè)抗原決定簇，一個(gè)動(dòng)物在受到抗原刺激以后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實(shí)質(zhì)是眾多B細(xì)

7、胞群的抗體分泌。 而針對(duì)一個(gè)目標(biāo)抗原表位的B細(xì)胞只占極少部分。 由于細(xì)胞融合是一個(gè)隨即的過程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中有相當(dāng)比例的無關(guān)細(xì)胞的融合體， 需經(jīng)篩選去除。篩選的過程分兩步：17陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存（1）融合細(xì)胞的抗體篩選（2）特異性抗體篩選 方法 將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分的稀釋，使其分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)量在 0 到數(shù)個(gè)之間（ 30% 的孔為 0才能保證單個(gè)孔中最多至含1個(gè)細(xì)胞）， 培養(yǎng)后取上清以ELISA方法選出抗體高分泌的細(xì)胞； 這一過程習(xí)慣上稱為Cloning ，即克隆化。將這些陽性細(xì)胞再進(jìn)行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的 ELISA 方法找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞

8、株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)。18第二節(jié) 單克隆抗體制備技術(shù)19201. 抗原提純與動(dòng)物免疫如沒有特殊的要求，一般選用68周齡的雌性BLAB/C小鼠。為獲得分泌抗目標(biāo)抗原抗體的B淋巴細(xì)胞，制備雜交瘤細(xì)胞必須免疫動(dòng)物。 免疫方案應(yīng)考慮抗原的性質(zhì)和純度、 免疫原性的強(qiáng)弱、 抗原的分子量和劑量、 免疫的途徑、 次數(shù)及間隔時(shí)間、佐劑的應(yīng)用及動(dòng)物對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答等。 應(yīng)能獲得足量的致敏 B 淋巴細(xì)胞。末次免疫結(jié)束后34d， 分離脾細(xì)胞融合。212.骨髓細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備選擇瘤細(xì)胞株最重要的一點(diǎn)是與待融合的B 細(xì)胞同源。Sp2/0-Ag14(Sp2/0)、 P3-NS-1-Ag4.1

9、 (NS-1)、P3-X63-Ag8.653(P3.653)是常用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞。在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因此，在培養(yǎng)融合細(xì)胞和細(xì)胞克隆化時(shí)，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell ) 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞。制備方法：用冷凍的果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠富強(qiáng)細(xì)胞。223. 細(xì)胞融合細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入 PEG 使細(xì)胞彼此融合。其后以培養(yǎng)液稀釋 PEG，消除 PEG 的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。應(yīng)注意：（1）細(xì)胞的比例 （2）反應(yīng)時(shí)間 （3）培養(yǎng)液成分234.抗

10、體初篩與克隆化一般在細(xì)胞融合成功后2周，即可取培養(yǎng)上清液檢測(cè)有無特異性抗體，常用的方法有ELISA法和RIA法等。一旦測(cè)得抗體陽性的培養(yǎng)孔，就必須立即進(jìn)行克隆化，即從中分離出單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之繁殖成為單一細(xì)胞系的群體。目前常用的克隆化方法是有限稀釋法。 245.雜交瘤細(xì)胞株的保存、復(fù)蘇 選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細(xì)胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在一70冰箱則活性改變較快。細(xì)胞不同于菌種,凍存過程中需格外小心。 二甲亞楓(DMSO)是普遍應(yīng)用的凍存保護(hù)劑。 凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50%95%之間。 如果低于50%,則說明凍存復(fù)蘇過程有問題。256.單克隆抗

11、體的批量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要分兩種，一種為小鼠體內(nèi)誘生法，另一種為體外增量培養(yǎng)法。目前制備單克隆抗體以體內(nèi)誘生法為主。先向小鼠腹腔注射降植烷(pristane)等造成無菌性腹膜炎，1周后將雜交瘤細(xì)胞配制成1106個(gè)/ml懸液注入小鼠腹腔，12周后小鼠可產(chǎn)生明顯腹水，收集腹水即可獲得高濃度的單克隆抗體。267.單克隆抗體的純化與鑒定單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化。腹水中特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果較好。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。純化方法： （1） 鹽析、凝膠過濾和離子交換層析。 （2） 親和層析法27單克隆抗體的鑒定包括：結(jié)合抗原的特異性、敏

12、感性 、親和力等。方法：與多克隆抗血清類似。282930單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用其主要用途如下:診斷各類病原體腫瘤特異性抗原和腫瘤 相關(guān)性抗原的檢測(cè)檢測(cè)淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志機(jī)體微量成分的測(cè)定31第三節(jié) 基因工程抗體技術(shù)基因工程抗體又稱重組抗體，是指應(yīng)用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同的需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。目前基因工程抗體技術(shù)主要包括： 1）應(yīng)用DNA重組和蛋白工程技術(shù)對(duì)已有的單抗進(jìn)行改造，包括人源化抗體、小分子抗體、雙價(jià)特異性抗體和抗體融合蛋白等的制備； 2）用抗體庫技術(shù)篩選、克隆新的單抗。 32一、人源化抗體嵌合抗體改形抗體33（一）嵌合抗體

13、1抗體V區(qū)基因的克隆 2抗體C區(qū)的選擇 3表達(dá)載體的構(gòu)建 4嵌合抗體的表達(dá) 34（二）改形抗體 改形抗體（reshaped antibody，RAb）是應(yīng)用基因工程技術(shù)在嵌合抗體基礎(chǔ)上用人抗體可變區(qū)的骨架區(qū)序列取代鼠源單抗CDR(互補(bǔ)決定區(qū))以外的骨架區(qū)序列，重新構(gòu)成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對(duì)人體幾乎無免疫原性。 1RAb的分子設(shè)計(jì) 2RAb的基因構(gòu)建35二、小分子抗體小分子抗體指分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段。優(yōu)點(diǎn)：免疫原性低且分子量小，易于穿透血管或組織到靶細(xì)胞部位，可用于免疫治療；可在大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)，降低生產(chǎn)成本；不含F(xiàn)C段，不會(huì)與帶有F

14、C段受體的細(xì)胞結(jié)合，副作用小；半衰期短，有利于中和并及時(shí)清除毒素。小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（Fab）、可變區(qū)片段（Fv）和單鏈抗體（single chain Fv，ScFv）等。36三、雙特異性抗體雙特異性抗體（bispecific antibody，BsAb）又稱雙功能抗體。它不同于天然抗體，其兩個(gè)抗原結(jié)合部位具有不同的特異性，可以同時(shí)與兩種不同特異性的抗原發(fā)生結(jié)合。BsAb可通過化學(xué)交聯(lián)法或?qū)煞N雜交瘤細(xì)胞融合而制備，也可采用基因工程技術(shù)制備。37雙特異性抗體包括化學(xué)交聯(lián)BsAb細(xì)胞工程BsAb 基因工程BsAb38（一）化學(xué)交聯(lián)BsAb分別分離純化兩種不同抗原的單抗，先使Ig解離后，

15、獲得單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體或其片段交聯(lián)起來。具體制備方法因?qū)嶒?yàn)室而異。此法易致抗體失活，其產(chǎn)物亦難以保證均質(zhì)性。39（二）細(xì)胞工程BsAb 是將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合產(chǎn)生二次雜交瘤。但后者所分泌的并非均一產(chǎn)物，兩套重鏈、輕鏈之間隨機(jī)重新組合的形式可多達(dá)10種?？赡軆H分泌兩種親本單抗，而無BsAb形成，也可能既分泌親本單抗又可分泌BsAb。BsAb在所有Ig形式中所占比例可為10%50%不等。 40（三）基因工程BsAb一般采用抗體分子片段，如ScFv或Fab等，經(jīng)基因操作修飾后，或在體外組裝成為BsAb，或直接導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)為分泌型的BsAb。41四、抗體融合蛋白抗體融合蛋白是指將抗體分子片段與其他蛋白融合所得到的產(chǎn)物。這種抗體融合蛋白具有多種生物學(xué)功能。例如將抗體Fab段或Fv與其他生物活性蛋白融合，就可將特定的生物學(xué)效應(yīng)導(dǎo)向靶部位；將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白融合，則可形成嵌合受體，賦予特定細(xì)胞以結(jié)合抗原的能力；若將非抗體蛋白與抗體分子的Fc段融合，可改善其藥代動(dòng)力學(xué)特性，并可使某些生物學(xué)活性與抗體的生物學(xué)功能相聯(lián)。42五、噬菌體抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)是指用細(xì)菌克隆代替B細(xì)胞克隆來表達(dá)抗體譜。它的出現(xiàn)基于PCR技術(shù)的發(fā)展和大腸桿菌直接表達(dá)性抗體分子片段的成功以及噬菌體顯示技術(shù)的問世。43