臨床免疫學(xué)與檢驗：第二十二章 免疫細(xì)胞的分離與檢測

1、第二十二章 免疫細(xì)胞的分離與檢測（ Separate and assay of immunity cell）免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、各種粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。 根據(jù)各類免疫細(xì)胞獨(dú)特的表面標(biāo)志及其特殊功能。用體外或體內(nèi)方法將各種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞從血液或臟器中分離出來，對其進(jìn)行數(shù)量和功能測定，是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的一種重要手段,也是細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)中進(jìn)行細(xì)胞分離、培養(yǎng)和建立細(xì)胞株等研究的重要基本技術(shù)之一。第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分離與純化白細(xì)胞的分離外周血單個核細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞的純化與亞群分離吞噬細(xì)胞的分離白細(xì)胞的分離血中紅

2、細(xì)胞和白細(xì)胞的比例約為6001000:1，兩類細(xì)胞密度不同，其沉降速度各異，通常用以下兩種方法分離。1自然沉降法是利用血細(xì)胞自然沉降率的分離方法。采集外周靜脈血，肝素抗凝，將含抗凝血的試管直立靜置室溫3060min后，由于紅細(xì)胞沉降速率較快，可使白細(xì)胞與之分離。上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，緊貼紅細(xì)胞層上面的灰白層為白細(xì)胞。吸取富含白細(xì)胞的細(xì)胞群，離心洗滌后加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經(jīng)短時間的低滲處理，使紅細(xì)胞裂解，經(jīng)過反復(fù)洗滌可得純度較高的白細(xì)胞懸液。 2聚合物加速沉降法某些高分子聚合物如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使紅細(xì)胞凝集成串，加速紅細(xì)胞沉降，

3、使之更易與白細(xì)胞分離。此法白細(xì)胞獲得率比自然沉降法高，但其中的明膠法可使白細(xì)胞粘性增加，對實驗產(chǎn)生一定影響。 二、外周血單個核細(xì)胞的分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是免疫學(xué)實驗中最常用的細(xì)胞群，也是進(jìn)行T細(xì)胞和B細(xì)胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。PBMC的密度與血液中的其他成分不同。血小板的密度為1.0301.035，粒細(xì)胞為1.092，紅細(xì)胞為1.093，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的密度為1.0751.090。利用一種密度介于1.0751.092之間、近于等滲的溶液(分層液)進(jìn)行密度梯度離心，可使不同類別的血細(xì)胞按

4、其相應(yīng)密度分布，從而被分離。常用的分層液有聚蔗糖-泛影葡胺分層液法和Percoll分層液法兩種。(一)聚蔗糖-泛影葡胺分層液法聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque,F-H)分層液法是分離PBMC一種單次密度梯度離心分離法。 (二)Percoll分層液法Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone,PVP)處理的硅膠顆?；鞈乙?，對細(xì)胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一，經(jīng)過高速離心后，可形成一個連續(xù)密度梯度，將密度不同的細(xì)胞分離純化。三、淋巴細(xì)胞的純化與亞群分離PBMC懸液主要含淋巴細(xì)胞，但一般還混雜有數(shù)量不等的單核細(xì)胞及少量粒細(xì)胞、

5、紅細(xì)胞和血小板。為獲得高純度的淋巴細(xì)胞或其亞群，可采用如下分離去除方法。(一)紅細(xì)胞的去除一般采用無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。(二)血小板的去除將PBMC懸液通過離心洗滌23次，?？扇コ齈BMC中絕大部分混雜的血小板。在某些疾病狀態(tài)下，若外周血中血小板數(shù)量異常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度離心法去除PBMC中混雜的血小板 。(三)單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的去除1粘附去除法 單核細(xì)胞和粒細(xì)胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝膠的特性，通過PBMC與玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。亦可應(yīng)用玻璃纖維或葡聚糖凝膠Sephadex G-10柱，清除粘附的細(xì)胞，洗脫液中主要

6、是淋巴細(xì)胞。此法簡便易行，對細(xì)胞損傷極少，缺點(diǎn)是B細(xì)胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細(xì)胞丟失。該法去除單核細(xì)胞后，大約95%的單個核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，活性大于95%。2羰基鐵粉吞噬法 單核細(xì)胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細(xì)胞密度增大，再經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心后，則單核細(xì)胞沉積于管底而被去除。也可在單核細(xì)胞懸液內(nèi)加入羰基鐵粉顆粒，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中即含較純的淋巴細(xì)胞。3苯丙氨酸甲酯去除法 苯丙氨酸甲酯(PME)具有親溶酶體性質(zhì)，能滲入細(xì)胞溶酶體內(nèi)被水解為游離氨基酸，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)因滲透壓改變而破裂，釋放出的酶類物質(zhì)可引起細(xì)胞溶

7、解。用該法可溶解含溶酶體的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和成纖維母細(xì)胞等，B細(xì)胞和大多數(shù)T細(xì)胞因缺乏溶酶體酶，因而不受影響。該法去除單核細(xì)胞后，約99%的單個核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，活性大于95%。(四)淋巴細(xì)胞亞群的分離淋巴細(xì)胞是復(fù)雜的不均一的細(xì)胞群體，它包括了許多形態(tài)相似而表面標(biāo)志和功能各異的細(xì)胞群和亞群。根據(jù)細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等不同，借助多種方法分離淋巴細(xì)胞亞群。1E花環(huán)分離法成熟的T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)受體，即E受體。T細(xì)胞能與SRBC結(jié)合形成E花環(huán)，而B細(xì)胞則不能。該方法簡便易行，所獲細(xì)胞的純度可達(dá)95%99%，可同時獲得B細(xì)胞。缺點(diǎn)是E花環(huán)形成后可能使T細(xì)胞活化。 2尼龍棉柱分

8、離法將淋巴細(xì)胞懸液加入尼龍棉柱內(nèi)，B細(xì)胞易粘附于尼龍棉纖維(聚酰胺纖維)表面，而T細(xì)胞則不易粘附，由此可將T細(xì)胞與B細(xì)胞分離。 該法簡便易行，不需特殊儀器，淋巴細(xì)胞活性不受影響，所獲T細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，B細(xì)胞純度可達(dá)80%。 3親和板結(jié)合分離法分為直接法和間接法。直接法是用特異性抗體包被塑料平皿或細(xì)胞培養(yǎng)板，表達(dá)特定膜抗原的細(xì)胞即與相應(yīng)抗體結(jié)合而被吸附于平皿或培養(yǎng)板表面，懸液中為不表達(dá)特定膜抗原的細(xì)胞(見圖24-3)。間接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)包被平皿，將預(yù)先與特異性單克隆抗體結(jié)合的淋巴細(xì)胞與之反應(yīng)后，可發(fā)生吸附固定，從而被分離。 4免疫磁珠分離法包括直接法和間接法。

9、直接法是將特異性抗體與磁性微粒(平均直徑小于1.5m)交聯(lián)，形成免疫磁珠(IMB)。IMB與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合，用強(qiáng)磁場分離磁珠結(jié)合細(xì)胞與磁珠非結(jié)合細(xì)胞，從而對特定細(xì)胞進(jìn)行陽性或陰性分選。間接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)包被磁性微珠，可與任何已結(jié)合鼠源性單克隆抗體(第一抗體)的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，從而對細(xì)胞進(jìn)行分離。 5流式細(xì)胞術(shù)分離法用流式細(xì)胞儀可自動化地對單個細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量測定分析，從而可分選出用特異性熒光抗體標(biāo)記的陽性細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)是分離細(xì)胞準(zhǔn)確、快速，純度達(dá)90%100%，回收率高，所分離的細(xì)胞可保持無菌，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性不受影響。缺點(diǎn)是費(fèi)用昂貴，擬分離的細(xì)胞在混合

10、群體中含量過低時，耗時較長才能獲得所需數(shù)量細(xì)胞。四、 吞噬細(xì)胞的分離體內(nèi)具有吞噬功能的細(xì)胞群按其形態(tài)的大小分為兩類：一類為大吞噬細(xì)胞，即血液中的單核細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞；另一類為小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。這兩類細(xì)胞在形態(tài)上各具特征，其分類和計數(shù)對診斷大多數(shù)感染性疾病具有重要參考價值。1單核細(xì)胞的分離用Percoll分層液法或粘附去除法可獲取人外周血單核細(xì)胞，但所獲得的細(xì)胞數(shù)量較少。2巨噬細(xì)胞的分離用斑蟊敷貼法可從人體組織滲出液中獲取巨噬細(xì)胞。用斑蟊乙醇浸液刺激前臂內(nèi)側(cè)皮膚，誘發(fā)無菌性皮炎，從皮泡滲出液中可獲取來自皮下組織中的巨噬細(xì)胞。該法獲取的巨噬細(xì)胞數(shù)量較多且純度較高，但對皮膚有一定損傷，

11、有時可引起局部感染，應(yīng)慎用。第二節(jié) 淋巴細(xì)胞的數(shù)量檢測（ Assay of the lymphocyte quantity）不同的淋巴細(xì)胞表面具有特定的表面標(biāo)志，借此可以對不同的淋巴細(xì)胞及其亞群進(jìn)行鑒定和計數(shù)。一、T細(xì)胞數(shù)量檢測間接熒光免疫法酶免疫組織化學(xué)法 微量細(xì)胞毒試驗 花環(huán)試驗 間接熒光免疫法間接熒光免疫法是通過檢測T細(xì)胞表面的CD抗原來了解外周血T細(xì)胞數(shù)量和亞群的變化。 方法：分離PBMC,分別與鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體進(jìn)行結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的羊(或兔)抗鼠IgG作為第二抗體，借助單克隆抗體的介導(dǎo)與PBMC結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，細(xì)胞膜上呈現(xiàn)特異性熒光的細(xì)胞即為

12、陽性細(xì)胞。計數(shù)100200個淋巴細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞確定T細(xì)胞及其亞群的百分率。 外周血T細(xì)胞及其亞群的平均正常值為: CD3+T細(xì)胞60%80%，CD4+T細(xì)胞55%60%，CD8+T細(xì)胞20%30%，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值約為2:1。如有條件，細(xì)胞經(jīng)熒光抗體著染后，可用流式細(xì)胞儀自動計數(shù)，快速而準(zhǔn)確。酶免疫組織化學(xué)法目前常用于鑒定T細(xì)胞和亞群的酶免疫組織化學(xué)法有ABC法和APAAP法。1.ABC法將親合素與酶標(biāo)生物素反應(yīng)形成復(fù)合物(avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)，再與生物素化的第二抗體反應(yīng)，借助T細(xì)胞的CD單克隆抗體介導(dǎo)和酶催化底物的

13、作用，可使T細(xì)胞著色。通過計數(shù)著色的陽性細(xì)胞數(shù)，可以確定T細(xì)胞及其亞群的百分率。2APAAP法分離PBMC,分別與鼠抗人CD3、CD4、和CD8的單克隆抗體反應(yīng)，用兔抗鼠IgG起搭橋作用，其中一個Fab段連接抗T細(xì)胞單克隆抗體，另一個Fab段連接堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(APAAP)復(fù)合物，再通過復(fù)合物中的堿性磷酸酶(AP)催化底物顯色來判斷CD抗原的存在，從而確定T細(xì)胞及其亞群的百分率。微量細(xì)胞毒試驗 針對淋巴細(xì)胞CD分子的單克隆抗體與淋巴細(xì)胞相應(yīng)的CD分子結(jié)合，借助補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，可造成表達(dá)特定表面抗原的細(xì)胞損傷，破壞膜的完整性，應(yīng)用伊紅染料滲入細(xì)胞內(nèi)，使之著染紅色，而無相應(yīng)CD分子

14、的細(xì)胞則不受損傷，因而不著色。在高倍鏡下計數(shù)死亡數(shù)，即可判斷待檢細(xì)胞是否具有相應(yīng)的CD分子，從而確定T細(xì)胞及其亞群?；ōh(huán)試驗 E花環(huán)試驗葡萄球菌花環(huán)法花環(huán)技術(shù)抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法 1E花環(huán)試驗(erythrocyte rosette test) T細(xì)胞表面有特異性綿羊紅細(xì)胞 (SRBC) 受體，即E受體。將T細(xì)胞與SRBC按一定比例混勻，置4至少2h或過夜，T細(xì)胞表面的E受體能與SRBC結(jié)合形成以T細(xì)胞為中心，四周環(huán)繞SRBC的花環(huán)樣結(jié)構(gòu)（圖24-5 ），鏡檢計數(shù)可得總花環(huán)(Et)形成率，亦即T細(xì)胞的百分率。 如減少淋巴細(xì)胞與SRBC的比例，兩者混合后，經(jīng)短時間后即行涂片染色，仍可見部分淋巴細(xì)胞

15、形成花環(huán)，稱為活性E(Ea)花環(huán)，它可能代表T細(xì)胞的一個亞群，Ea花環(huán)正常值僅為Et花環(huán)的1/31/2，約20%40%。檢測Ea花環(huán)形成細(xì)胞比Et花環(huán)形成細(xì)胞更能反映受檢者的細(xì)胞免疫水平。 2葡萄球菌花環(huán)法花環(huán)技術(shù)葡萄球菌蛋白A(SPA)可與多種動物的IgGFc段結(jié)合而不影響抗體的活性。應(yīng)用金黃色葡萄球菌結(jié)合單克隆抗體(直接法)或兔抗鼠IgG抗體(間接法)，所形成的SPA-IgG復(fù)合物可與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合，使金黃色葡萄球菌被動吸附在細(xì)胞周圍形成花環(huán)狀。通過計數(shù)花環(huán)形成細(xì)胞百分率，從而確定T淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)量。 3抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法采用戊二醛交聯(lián)技術(shù)將單克隆抗體或兔抗鼠IgG與SRB

16、C結(jié)合，制成致敏的SRBC。抗體致敏的SRBC可與T淋巴細(xì)胞直接或間接結(jié)合，在T淋巴細(xì)胞周圍形成花環(huán)。通過計數(shù)花環(huán)形成率，從而確定T淋巴細(xì)胞及其亞群的百分率。二、B細(xì)胞數(shù)量檢測B細(xì)胞表面有：膜表面免疫球蛋白(SmIg)、CD抗原、Fc受體、補(bǔ)體受體、EB病毒受體和小鼠紅細(xì)胞受體等標(biāo)志，據(jù)此可對B細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量檢測。1SmIg的檢測SmIg為B細(xì)胞所特有，是鑒定B細(xì)胞的可靠指標(biāo)。大多采用熒光素或酶標(biāo)記的抗人Ig抗體通過直接熒光免疫法或酶免疫組織化學(xué)法檢測SmIg，正常人外周血中SmIg+細(xì)胞一般為8%12%。2CD抗原檢測B細(xì)胞表面抗原有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，

17、其中有些是全部B細(xì)胞所共有，而有些僅活化B細(xì)胞所特有，據(jù)此可用相應(yīng)的系列單克隆抗體，通過間接熒光免疫法或酶免疫組織化學(xué)法加以檢測。正常成年人外周血CD20陽性細(xì)胞約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的8%12%。3Fc受體和補(bǔ)體受體的檢測B細(xì)胞表面具有與IgG Fc段結(jié)合的受體，極易與抗原抗體復(fù)合物中抗體Fc 段結(jié)合，故用相應(yīng)抗體致敏的紅細(xì)胞(EA)作指示物，在一定條件下，它能與帶Fc受體的B細(xì)胞形成EA花環(huán)，故稱EA花環(huán)試驗。而B細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體，則能與紅細(xì)胞(E)-抗紅細(xì)胞抗體(A)-補(bǔ)體(C)復(fù)合物(EAC)中的補(bǔ)體相結(jié)合，從而建立EAC花環(huán)試驗。3.小鼠紅細(xì)胞受體的檢測部分B細(xì)胞能與小鼠紅細(xì)胞形成花環(huán)，

18、慢性B細(xì)胞白血病患者外周血淋巴細(xì)胞形成小鼠紅細(xì)胞花環(huán)率高達(dá)60%85%，但健康人該花環(huán)率僅占總淋巴細(xì)胞的5%10%，據(jù)此推知形成該花環(huán)的性能是某些B細(xì)胞亞群的標(biāo)志。第三節(jié)、淋巴細(xì)胞的功能檢測（ Assay of lymphocyte faction）T細(xì)胞功能檢測 B細(xì)胞功能檢測 NK細(xì)胞活性測定一、T細(xì)胞功能檢測 T細(xì)胞增殖試驗 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗 體內(nèi)試驗（一）T細(xì)胞增殖試驗T細(xì)胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細(xì)胞的代謝和形態(tài)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應(yīng)，如細(xì)胞變大、胞質(zhì)增多、胞質(zhì)現(xiàn)空泡、核染色質(zhì)疏松、核仁明顯，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞（見表24-6

19、）。因此，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)又稱淋巴細(xì)胞母細(xì)胞轉(zhuǎn)化(lymphoblast transformation)。常用刺激物體外刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的刺激物包括植物血凝素 (PHA)刀豆素A(ConA)美洲商陸(PWM)白喉類毒素破傷風(fēng)類毒素純化蛋白衍生物(PPD)白色念珠菌檢測T細(xì)胞增殖反應(yīng) 1形態(tài)學(xué)檢查法 23H-TdR摻入法3MTT比色法 1形態(tài)學(xué)檢查法分離PBMC，與適量PHA混合，置37培養(yǎng)72h。取培養(yǎng)細(xì)胞作涂片染色，借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測。根據(jù)細(xì)胞的大小、核與胞質(zhì)的比例、胞質(zhì)的染色性以及有無核仁等特征(見圖24-6)，分別計數(shù)未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，每份標(biāo)本計數(shù)200個細(xì)胞，按公

20、式計算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率= 轉(zhuǎn)化率在一定程度上可反映細(xì)胞免疫功能，正常人的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60%80%，小于50%可視為降低。形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實驗室應(yīng)用。缺點(diǎn)是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。23H-TdR摻入法T細(xì)胞在有絲分裂原或抗原刺激下，在轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞的過程中，DNA合成明顯增加，且其轉(zhuǎn)化程度與DNA的合成呈正相關(guān)。在終止培養(yǎng)前816h，若將3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)加入到培養(yǎng)液中，即被轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞攝取而摻入到新合成的DNA中。培養(yǎng)結(jié)束后，用液體閃爍儀測定淋巴細(xì)胞內(nèi)放射性核素量，記錄每分鐘脈

21、沖數(shù)(cpm)，計算刺激指數(shù)(stimulating index，SI)，判斷淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度。 PHA刺激管cpm均值 SI= 對照管cpm均值 3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好，可自動操作。但需一定設(shè)備條件，受放射性核素半衰期和污染的影響 3MTT比色法MTT是一種噻唑鹽，化學(xué)名為3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)。將淋巴細(xì)胞與絲裂原共同培養(yǎng)，在細(xì)胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時加入MTT，混勻繼續(xù)培養(yǎng)，MTT作為細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的底

22、物參與反應(yīng)，形成藍(lán)黑色的甲替顆粒，并沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍。甲月替可被隨后加入的鹽酸異丙醇或二甲基亞砜完全溶解，用酶標(biāo)測定儀測定細(xì)胞培養(yǎng)物的A570nm值。因甲月替的生成量與細(xì)胞增殖水平呈正相關(guān)，故樣品的A570n值可反映細(xì)胞增殖水平，以刺激指數(shù) (SI) 判斷淋巴細(xì)胞增殖程度。試驗孔A570nm均值 SI=對照孔A570nm均值本方法的敏感性雖不及3H-TdR摻入法，但操作簡便，無放射性污染。 (二)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞( CTL)的特性，凡致敏的T細(xì)胞再次遇相應(yīng)的靶細(xì)胞抗原， 可表現(xiàn)出對靶細(xì)胞的破壞和溶解作用， CTL 主要通過細(xì)胞裂解和細(xì)胞凋

23、亡兩種機(jī)制殺傷靶細(xì)胞。 試驗的原則是選用適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞，常用可傳代的已建株的人腫瘤細(xì)胞如人肝癌細(xì)胞、食管癌、胃癌等細(xì)胞株，經(jīng)培養(yǎng)后制成單個核細(xì)胞懸液，按一定比例與待檢的淋巴細(xì)胞混合，共溫一定時間，觀察腫瘤細(xì)胞被殺傷情況。1形態(tài)學(xué)檢查法 待檢細(xì)胞與相應(yīng)的靶細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞等)混合共育后，以瑞氏染液染色，用顯微鏡計數(shù)殘留的腫瘤細(xì)胞數(shù)，通過計算淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率，判斷效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性。251Cr釋放法用Na251CrO4標(biāo)記靶細(xì)胞，若待檢細(xì)胞能殺傷靶細(xì)胞，則51Cr從靶細(xì)胞內(nèi)釋放出來，用計數(shù)儀測定靶細(xì)胞釋放的51Cr放射活性。靶細(xì)胞溶解破壞越多，51Cr釋放越多，上清液的放射活性越強(qiáng)，通

24、過計算51Cr特異釋放率，判斷淋巴細(xì)胞的殺傷活性。3細(xì)胞凋亡檢查法形態(tài)學(xué)方法電泳法 ELISA法 TUNEL法 流式細(xì)胞術(shù) (1)形態(tài)學(xué)方法將待檢淋巴細(xì)胞和靶細(xì)胞按比例混合，培養(yǎng)一定時間后，取培養(yǎng)物涂片，借助普通光學(xué)顯微鏡(HE染色)、熒光顯微鏡(碘化丙錠染色)或透射電鏡可對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核致密濃染、核碎裂等。該法簡便、經(jīng)濟(jì)，可定性，但不能定量。(2)電泳法將待檢淋巴細(xì)胞細(xì)胞和靶細(xì)胞按比例混合，培養(yǎng)一定時間后，對凋亡細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，由于內(nèi)源性核酸酶的激活，DNA鏈被切割成為180200bp或其倍數(shù)的DNA片段，故在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)“DNA梯狀圖譜”。該

25、法簡便，可定性和定量，但無法顯示凋亡細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。 (3) ELISA法凋亡細(xì)胞內(nèi)DNA裂解產(chǎn)生單/低聚體核小體片段，核小體DNA與組蛋白形成緊密結(jié)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解。采用雙抗體夾心ELISA法，應(yīng)用抗組蛋白和抗DNA單克隆抗體，可特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體，該法可定性和定量。(4)TUNEL法將待檢效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞按比例混合，培養(yǎng)一定時間后，取培養(yǎng)物涂片。凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸酶的激活，核DNA被切割，其每個片段均含有3-OH末端，加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生物素標(biāo)記的核苷酸(dUTP-biotin)，TdT能在3-OH末端連接上生物素標(biāo)記的核苷酸，利用親合素-生物素-酶

26、放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞。正常細(xì)胞無DNA斷裂，則不顯色。光鏡下檢查計數(shù)凋亡細(xì)胞，可反映待檢細(xì)胞的殺傷活性。該法所用標(biāo)記核苷酸多為dUTP，故稱TUNEL法(TdT dependent dUTP-biotin nick end labeling)。 該法測定凋亡細(xì)胞數(shù)目特異性強(qiáng)，靈敏度高，形態(tài)上尚未發(fā)生典型變化的凋亡細(xì)胞也可以早期顯示，但試劑昂貴。上述方法中也可將生物素標(biāo)以熒光素，用流式細(xì)胞儀直接測定凋亡細(xì)胞數(shù)。(5)流式細(xì)胞術(shù)凋亡細(xì)胞因核斷裂，呈亞二倍體，因此可用流式細(xì)胞儀分析亞二倍體數(shù)目，指示細(xì)胞凋亡程度。流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞敏感性高、可自動化操作，已成為

27、研究凋亡的重要手段之一。(三)體內(nèi)試驗 本試驗不僅可以檢查受試者是否對某種抗原具有特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，而且可以檢查受試者總體細(xì)胞免疫狀態(tài)。目前臨床上常用于診斷某些病原微生物感染(結(jié)核、麻風(fēng)等) 和細(xì)胞免疫缺陷等疾病，也常用于觀察細(xì)胞免疫功能在治療過程中的變化及判斷預(yù)后等。1特異性抗原皮膚試驗 2PHA皮膚試驗 3二硝基氯苯或二硝基氟苯皮膚試驗 二、B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞增殖試驗 溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法 體內(nèi)試驗 (一)B細(xì)胞增殖試驗與T細(xì)胞增殖試驗相同，但刺激物不同，小鼠B細(xì)胞可用細(xì)菌脂多糖(LPS)作為刺激物，人則用含SPA的金黃色葡萄球菌菌體及抗IgM抗體刺激。 (二)溶血空斑試驗(

28、hemolytic plaque assay)經(jīng)典溶血空斑形成試驗用于檢測實驗動物抗體形成細(xì)胞的功能。將SRBC免疫的小鼠脾臟制成單個細(xì)胞懸液，與SRBC在瓊脂糖凝膠內(nèi)混合傾注于小平皿或玻片上。脾細(xì)胞中的抗體生成細(xì)胞釋放抗SRBC抗體，使其周圍的SRBC致敏，在補(bǔ)體參與下可將SRBC溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。每一個空斑中央含一個抗體形成細(xì)胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細(xì)胞數(shù)?？瞻叽笮”硎究贵w形成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少。 (三)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immune spot ,ELISPOT)用抗原包被固相載體，加入待檢的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，即可誘導(dǎo)抗體的分泌。分泌的抗體與包被抗原結(jié)合，

29、在抗體分泌細(xì)胞周圍形成抗原抗體復(fù)合物，使細(xì)胞吸附于載體上，加入酶標(biāo)記的第二抗體與細(xì)胞上的抗體結(jié)合，通過底物顯色反應(yīng)的深淺，可測定出生成的抗體量，并可在鏡下計數(shù)著色的斑點(diǎn)形成細(xì)胞。該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量，其優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細(xì)胞。三、NK細(xì)胞活性測定NK細(xì)胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD59等多種抗原，但均非NK細(xì)胞所特有，現(xiàn)今極少以CD系列抗原為指標(biāo)鑒定和計數(shù)NK細(xì)胞，而多檢測NK細(xì)胞活性。NK細(xì)胞具有細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，能直接殺傷靶細(xì)胞。測

30、定人NK細(xì)胞活性多以K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，而測定小鼠NK細(xì)胞活性常采用YAC-1細(xì)胞株作為靶細(xì)胞。(一)形態(tài)學(xué)法以人PBMC或小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，與靶細(xì)胞按一定比例混合溫育，用臺盼藍(lán)或伊紅Y等活細(xì)胞拒染的染料處理，光鏡下觀察著染的死亡細(xì)胞，計算出靶細(xì)胞的死亡率即為NK細(xì)胞的活性。該法簡便易于掌握，但結(jié)果判斷具有一定的主觀性，也無法計數(shù)輕微損傷的細(xì)胞。 (二)酶釋放法乳酸脫氫酶(LDH) 是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一。正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)靶細(xì)胞受到效應(yīng)細(xì)胞的攻擊而損傷時，細(xì)胞膜通透性改變，LDH從胞漿中釋出。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶(NAD+)

31、變成還原型輔酶(NADH2)。后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)(INT) 或硝基藍(lán)四氮唑(NBT)，形成有色的甲月替類化合物，在570nm波長處有一高吸收峰，利用讀取的A值，經(jīng)過計算即可得知NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性。 也可采用NAG酶熒光比色法測定NK細(xì)胞活性。NAG酶(N-乙酰-D-氨基己糖酶)存在于溶酶體中，當(dāng)其由受損的靶細(xì)胞釋出后，可與底物作用而生成熒光物質(zhì)，應(yīng)用熒光光度計測定，重復(fù)性好。(三)化學(xué)發(fā)光法NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時發(fā)生呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量活性氧自由基，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)和單態(tài)氧(1O2)等。它們與細(xì)胞

32、內(nèi)某些可激發(fā)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生微弱的發(fā)光現(xiàn)象。在反應(yīng)體系中加入魯米諾(luminol)能起增強(qiáng)效應(yīng)，從而使發(fā)光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，發(fā)光強(qiáng)度與NK細(xì)胞活性呈正相關(guān)?；瘜W(xué)發(fā)光測定法操作簡便快速，樣品用量少，是氧化爆發(fā)檢測中最為敏感，并可直接定量的方法。(四)時間分辨熒光免疫分析法將靶細(xì)胞用鑭系元素銪(Eu3+)的螯合物標(biāo)記，經(jīng)與效應(yīng)細(xì)胞共溫后，用時間分辨熒光分析儀檢測熒光，可除去非特異性熒光本底。本法實驗時間短，效靶細(xì)胞僅需共溫2h，檢測速度快，特異性強(qiáng)。(五)流式細(xì)胞術(shù)利用碘化丙啶染料排斥法，碘化丙啶(PI)只能滲透到死亡細(xì)胞內(nèi)并與DNA和RNA結(jié)合，在488nm波長激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光。同時，NK細(xì)胞

33、體積及光散射特性均不同于靶細(xì)胞。據(jù)此，可用流式細(xì)胞術(shù)檢測受NK細(xì)胞作用后靶細(xì)胞的死亡率來反映NK細(xì)胞的活性。(六)放射性核素釋放法應(yīng)用放射性核素51Cr或125I-UdR標(biāo)記靶細(xì)胞，當(dāng)靶細(xì)胞受到NK細(xì)胞攻擊后，靶細(xì)胞被破壞，釋放出放射性核素，通過測定上清和細(xì)胞部分的放射性強(qiáng)度(以cpm值表示)計算NK細(xì)胞活性。本法敏感性較高，結(jié)果客觀精確。缺點(diǎn)是靶細(xì)胞的放射性核素自然釋放率較高，51Cr半衰期短，試驗設(shè)備要求較高，并存在放射性核素污染。第一節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測（Assay the macrocyte faction ）吞噬細(xì)胞的吞噬運(yùn)動大致分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺傷作用三個階段，可分別對這三個階段

34、進(jìn)行功能檢測。一、中性粒細(xì)胞功能檢測(一)趨化功能檢測(二)吞噬和殺菌功能測定 (一)趨化功能檢測中性粒細(xì)胞在趨化因子如微生物的細(xì)胞成分及其代謝產(chǎn)物、補(bǔ)體活性片段C5a、C3a、某些細(xì)胞因子等作用下產(chǎn)生趨化運(yùn)動。趨化運(yùn)動是整個吞噬過程的第一步，對吞噬功能影響很大。 1濾膜滲透法又稱Boyden 小室法。上室加待檢細(xì)胞，下室加趨化因子，上下室用微孔濾膜隔開。反應(yīng)后，取濾膜清洗、固定、染色和透明，在高倍鏡觀察細(xì)胞穿越濾膜的移動距離，從而判斷其趨化作用。2瓊脂糖平板法將瓊脂糖溶液傾倒在玻片上制成瓊脂糖凝膠平板，在中央內(nèi)孔加白細(xì)胞懸液，兩側(cè)孔內(nèi)分別加趨化因子或?qū)φ找?。反?yīng)后通過固定和染色，測量白細(xì)胞向

35、左側(cè)孔移動距離即趨向移動距離 (A) 和向右側(cè)孔移動的距離即自發(fā)移動距離 (B)，計算趨化指數(shù)(A/B)，判斷細(xì)胞的定向移動能力。 (二)吞噬和殺菌功能測定1顯微鏡檢查法 將白細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性美蘭液染色。在油鏡下觀察靶細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬情況，計數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)。對有吞噬作用的白細(xì)胞，應(yīng)同時記錄所吞噬的細(xì)菌數(shù)。 吞噬率(%)=吞噬指數(shù)= 殺菌率(%)= 2溶菌法將白細(xì)胞懸液與經(jīng)新鮮人血清調(diào)理過的細(xì)菌(大腸桿菌或金黃色葡萄球菌)按一定比例混合，溫育。每隔一定時間取定量培養(yǎng)物，稀釋后接種固體平板培養(yǎng)基。37培養(yǎng)18h后，計數(shù)生長菌落數(shù)，以了解中性粒細(xì)胞的殺菌能力。殺菌率(%)= 3NBT還原試驗中性粒細(xì)胞在吞噬殺菌過程中，能量消耗劇增，耗氧量也隨之增相應(yīng)增加，磷酸己糖旁路的代謝活性增強(qiáng)，6-磷酸葡萄糖脫氫酶使葡萄糖的中間代謝產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖氧化脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)槲焯?。如加入硝基藍(lán)四氮唑 (