測(cè)定葉綠素a和b的方法及其計(jì)算

1、實(shí)驗(yàn)二十五 測(cè)定葉綠素a和b的方法及其計(jì)算時(shí)間：2021.01.01創(chuàng)作歐陽(yáng)美一目的要求：熟悉在未經(jīng)分離的葉綠體色素溶液中測(cè)定葉綠素a和 b的方法及其計(jì)算。二實(shí)驗(yàn)原理：如果混合液中的兩個(gè)組分，它們的光譜吸收峰雖然有 明顯的差異，但吸收曲線彼此有些重疊，在這種情況下要分 別測(cè)定兩個(gè)組分，可根據(jù)Lambert-Beer定律，通過代數(shù)方 法，計(jì)算一種組分由于另一種組分存在時(shí)對(duì)光密度的影響， 最后分別得到兩種組分的含量。如圖z-4葉綠素a和b的吸收光譜曲線，葉綠素a的最 大吸收峰在663nm,葉綠素b在645nm,吸收曲線彼此又有 重疊。圖z-4葉綠素a和b的吸收光譜曲線橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)（mn）,縱坐標(biāo)為

2、比吸收系數(shù)根據(jù)Lambert-Beer定律，最大吸收光譜峰不同的兩個(gè)組 分的混合液，它們的濃度C與光密度0D之間有如下的關(guān) 系：0Dl=Ca kal+Cb kbl（1）0D2=Ca ka2+Cb kb2（2）式中：Ca為組分a的濃度，g/LoCb為組分b的濃度，g/Lo0D1為在波長(zhǎng)入1 （即組分a的最大吸收峰波長(zhǎng)）時(shí)，混 合液的光密度0D值。0D2為在波長(zhǎng)入2 （即組分b的最大吸收峰波長(zhǎng)）時(shí)，混 合液的光密度0D值。koi為組分a的比吸收系數(shù)，即組分Q當(dāng)濃度為lg/L 時(shí)，于波長(zhǎng)X 1時(shí)的光密度0D值。kb2為組分b的比吸收系數(shù)，即組分b當(dāng)濃度為lg/L 時(shí)，于波長(zhǎng)入2時(shí)的光密度0D值。ka

3、2為組分a （濃度為lg/L）,于波長(zhǎng)入2時(shí)的光密度 0D值。kbl為組分b （濃度為lg/L）,于波長(zhǎng)入1時(shí)的光密度0D值。從文獻(xiàn)中可以查到葉綠素a和b的80%丙酮溶液，當(dāng)濃度為lg/L時(shí)，比吸收系數(shù)k值如下:波長(zhǎng)（nm）葉綠素a葉綠素b66382.049.2764516.7545.60將表中數(shù)值代入上式（1）、（2）,則得:0D663二82. 04X5+9. 27XCb 0D645二 16. 75X5+45. 60XCb經(jīng)過整理之后，即得到下式:5二0.0127 OD663-0.00269 0D645Cb=0.0229 0D645-0.00468 0D663如果把Ca, Cb的濃度單位從原

4、來的g/L改為mg/L,則上式可改寫為下列形式：Ca=12.70D663-2.690D645Cb二22. 90D645-4.680D663CT二 Ca+Cb=8.02 0D663+20. 210D645（5）（5）式中CT為總?cè)~綠素濃度，單位為mg/Lo利用上面（3）、（4）、（5）式，即可計(jì)算出葉綠素a和b及總?cè)~綠素的濃度（mg/L）。附注一般大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用的分光度計(jì)多為721型，屬 低級(jí)類型，其單色光的半波寬要比中級(jí)類型的751型寬得多，而葉綠素3和b吸收峰的波長(zhǎng)相差僅18nm （663-645nm）,難以達(dá)到精確測(cè)定。此外有時(shí)還由于儀器本身的 標(biāo)稱波長(zhǎng)與實(shí)際波長(zhǎng)不符，測(cè)定的正確性就更

5、差，不適用于 測(cè)定。751型有時(shí)也由于波長(zhǎng)不夠準(zhǔn)確，會(huì)帶來一定誤差。可用葉綠素對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行校正。為校正儀器波長(zhǎng)所需的葉綠素a和b的需要量很少，用 紙層析法很快就能分離制得。取植物葉子約lg,用乙瞇提取 葉綠體色素，再用毛細(xì)管將色素溶液畫在3mm厚濾紙上使成 一宜線，為使分離效果好，一般重復(fù)點(diǎn)樣一次即可。然后于 密閉容器中進(jìn)行上行層析，溶劑為含有0.5%丙酮的石油瞇。 層析結(jié)束，用剪刀小心地剪下藍(lán)綠色的葉綠素a和黃綠色的 葉綠素b,注意剪時(shí)盡量避開分層不清晰的色區(qū)。最后分別 浸于80%丙酮中，洗下葉綠素a和b。三 實(shí)驗(yàn)器材與試劑：1.實(shí)驗(yàn)儀器 高級(jí)型分光光度計(jì)、 離心機(jī)、臺(tái)天平、剪刀、研缽、漏斗、

6、移液管。2實(shí)驗(yàn)試 劑 丙酮、碳酸鈣。3.實(shí)驗(yàn)材料 植物葉片。四 操作步驟： 1、色素的提取：取新鮮葉片，剪去粗大的葉脈并剪成碎 塊，稱取0. 5g放入研缽中加純丙酮5ml,少許碳酸鈣和石 英砂，研磨成勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)入量筒中，并用適量80%丙酮 洗滌研缽，用80%丙酮定容至10ml,吸取2. 5ml加入有 10ml80%丙酮的量筒中，過濾，濾液備用。2、測(cè)定光密度： 取上述色素提取液4ml,轉(zhuǎn)入比色杯中，以80%丙酮為對(duì) 照，分別測(cè)定663nm. 645nm處的光密度值。3、按公式(3)、(4)、(5)分別計(jì)算色素提取液中葉綠素a、葉綠素b、及葉綠素a+b的濃度。再根據(jù)稀釋倍數(shù)分別計(jì)算每g 鮮重葉片中色素的含量?！咀⒁馐马?xiàng)】1由于植物葉子中含 有水分，故先用純丙酮進(jìn)行提取，以使色素提取液中丙酮的 最終濃度近似80%。2.由于葉綠素a. b的吸收峰很陡，儀 器波長(zhǎng)稍有偏差，就會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生很大的誤差，因此最好能 用波長(zhǎng)較正確的高級(jí)型分光光度計(jì)。五作業(yè)：1、試比較陰 生植物和陽(yáng)生植物的葉綠素a