熒光分光光度計的使用

1、熒光分光光度計的使用實驗?zāi)康模赫莆諢晒夥止夤舛扔嫷幕臼褂梅椒?、掃描激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強度等。掌握熒光定量分析方法。實驗原理：熒光分光光度計是常用的光學(xué)儀器，在定量分析樣品的光譜性質(zhì)表片時經(jīng)常用到。熒光分光光度計的基本功能是完成激發(fā)光譜，發(fā)射光譜的掃描，進行相對熒光強度的測理。 從激發(fā)光濂可以獲得樣品激發(fā)態(tài)能級的分布情況，用來選擇定量分析的最佳激發(fā)波長。從發(fā) 射光譜可以知道樣品基態(tài)能級的分布情況。用來選擇定量分析的最佳發(fā)射波長。熒光定量分 析法的方法與紫外可見吸收光譜類似。但需要注意熒光強度值是相對值。同一樣品，同一儀 器在不同儀器參數(shù)時獲得的熒光強度是不同的。只有當(dāng)測量儀器參數(shù)完全相同

2、時，不同的樣 品熒光強度的相互比較才有意義。與紫外可見吸收光譜類似，分子熒光光譜也是分子光譜，其譜峰較寬，片片性不是很強。 譜峰重疊現(xiàn)象比較普遍。為了減小譜峰寬度。避免譜峰重疊，提高分析的選擇性，在定量分 析時常采用同步熒光的方法進行。同步熒光是同時掃描熒光分光光度計的激發(fā)和發(fā)射單色 儀得到的譜圖。通過選擇合適的掃描參數(shù)?？梢允箻悠纷V峰變窄，并避免不同組份的譜峰重 疊，得到比較好的分析效果。同步熒光掃描有固定波長同步熒光法，固定能量同步熒光法，可變角同步熒光法等。掃描已知樣品熒光激發(fā)和發(fā)射光譜時，可先根據(jù)參考波長來進行。掃描末知樣品的熒光光譜， 可以將發(fā)身波長先每隔一定波長（例如50nm）掃描

3、一個激發(fā)光譜，對比不同位置的激發(fā)光 譜，從最強的激發(fā)光譜中選擇最大激發(fā)波長，設(shè)定該波長為激發(fā)波長，掃描發(fā)射光譜。再從 新得到的發(fā)射光譜中找到最大發(fā)射波長，在最大的發(fā)射波長處重新掃描激發(fā)光譜。掃描樣品激發(fā)光譜和發(fā)射光譜時，需要注意：掃描激發(fā)光譜時，激發(fā)單色器掃描范圍的 長波端一般應(yīng)小于發(fā)射波長；掃描發(fā)射光譜時，發(fā)射單色器掃描范圍的短波端應(yīng)大于激發(fā)波 長。否則在發(fā)射光譜（激發(fā)光譜）中與激發(fā)波長（發(fā)射波長）波長相同的位置會出現(xiàn)很強的 散射譜峰。這不是樣品的熒光引起的，應(yīng)當(dāng)注意區(qū)分。如果樣品不是真正的溶液，或包含有不溶性顆粒物，或是固樣性品，如果掃描范圍較寬時， 通常在發(fā)射光譜（激發(fā)光譜）中波發(fā)波長（

4、發(fā)射波長）速數(shù)倍波長的位置也會出現(xiàn)較弱的散 射譜峰，稱為倍頻峰。在分析光譜情況時也應(yīng)當(dāng)注意區(qū)分。對散射倍頻峰或樣品熒光峰，可 通過適當(dāng)改變激發(fā)波長來進行區(qū)分。散射倍頻峰的位置也會隨著激發(fā)峰的位置變化而變化。 而熒光峰的位置通常是不變的。如果倍頻峰對樣品的測是有干擾，可使用合適的濾光片消除 倍頻峰。合適的消倍頻峰濾光片應(yīng)可以使發(fā)射光透過，阻擋激發(fā)光透過。如果樣品熒光較弱，使用高靈敏度檔測定時，通常會觀察到溶濟的拉曼峰。也應(yīng)當(dāng)注意 與樣品熒光進行區(qū)分。拉曼峰的位置也與激發(fā)波長有關(guān)，同時也隨著激發(fā)波長的變化而變化， 其位置可以估算出來。實驗材料：FITC-OVA蛋白質(zhì)溶液FITC最大吸收光譜為：49

5、0-495nm最大發(fā)射光譜為：520-530nm呈黃綠色熒光實驗內(nèi)容：1、FITC-OVA蛋白質(zhì)，進行不同濃度、不同激發(fā)波長、固定發(fā)射波長下的數(shù)值變化。發(fā)激波長發(fā)射波長480nm525nm485nm525nm490nm525nm495nm525nm500nm525nm505nm525nm510nm525nm將FITC-OVA樣品超純水稀釋成不同濃度，吸100ul置于96孔板中，讀熒光光度計值。2、FITC-OVA蛋白質(zhì)，進行不同濃度、相同激發(fā)波長、不同發(fā)射波長下的數(shù)值變化。激發(fā)波長發(fā)射波長493nm500nm493nm510nm493nm515nm493nm520nm493nm525nm493

6、nm530nm493nm540nm將FITC-OVA樣品超純水稀釋成不同濃度，吸100ul置于96孔板中，讀熒光光度計值。3、固定激發(fā)波長、固定發(fā)射波長，F(xiàn)ITC-OVA在不同溶液中，熒光分光光度數(shù)值比較。激發(fā)波長發(fā)射波長493nm525nm將FITC-OVA樣品超純水稀釋、用生理鹽水稀釋、用自來水稀釋成不同濃度， 吸100ul置于96孔板中，讀取熒光光度計讀取的數(shù)值。實驗結(jié)果：1、不同的激發(fā)波長、固定發(fā)射波長情況下，F(xiàn)ITC-OVA熒光光度計測定結(jié)果:激發(fā)波長nm發(fā)射波長nm樣品的濃度480485490495500505510525原液原液1： 10原液1： 100原液1： 1000空白2、相財?shù)募ぐl(fā)波、不同的發(fā)射波長情況下，F(xiàn)ITC-OVA熒光光度計測定結(jié)果:激發(fā)波長nm發(fā)射波長nm樣品的濃度493500510515520525530540原液原液1： 10原液1： 100原液：1000空白3、激發(fā)波長493nm,發(fā)射波長525nm時，不同的溶液稀釋樣品時，F(xiàn)ITC-OVA熒光光度計的 測定結(jié)果:超純水稀釋生理鹽水稀釋自來水