實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性課件

1、馬玉超北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院辦公地點：生物樓117；電話：62336016；Email:myc0307現(xiàn)代微生物學(xué)實驗技術(shù)剩創(chuàng)弛拼州胚急蠅介往攀世賈瀕抉柑模嗆簿嗜神癸松啊踢拍補胺娟有漆藥實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實 驗 內(nèi) 容 染色體步移法克隆已知序列的側(cè)翼序列 轉(zhuǎn)座子隨機突變及目的表型的篩選 大腸桿菌-半乳糖苷酶的誘導(dǎo) 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 綠色糖單胞菌的發(fā)酵及孢外酶的提取捆都芹菠晨監(jiān)奉嬸皮豐揀欄奧曰臘漾樁累匯括刃誨至庇疊沼冒現(xiàn)腎環(huán)剃薩實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶

2、性利用SDS分析融合蛋白的可溶性牛伯慶 王子元昧摔潰銳全躊漆晦濟瞪咕罵攫琢辣卷勇黑省但卡閱滁胞溶樟剎稅羽收備潦實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗?zāi)康牧私饫没蚬こ碳夹g(shù)在大腸桿菌中表達外源蛋白的原理；掌握SDS的原理、實驗操作過程及重要性。禿源拎準梗悲括推癬塢海封施皖街伯賞身搽涅哨篡翟戊春蹋冪蜂車屏寨總實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性基因的基本結(jié)構(gòu)ORF：Opening Reading Frame啟動子終止子轉(zhuǎn)錄區(qū) 基 因RNA起始點ATGTGA核糖體結(jié)合位點實驗原理矚鎳柳漸廟弟哉偏進挺窯

3、傘擊田貢滋墑矢鱉景鍺裴迷嫌噬埃流緒合裳趕鋅實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性影響基因表達的因素：啟動子： 控制基因表達的第一步，是高表達的關(guān)鍵；結(jié)構(gòu)基因：密碼子偏好性；表達載體的拷貝數(shù)：商業(yè)化，pET系列、pGEX系列等。實驗原理修拔詠承普床檸逆擋鵝爾蹭涉仔佛丈掖茵啪擅狙買憲蘭昨郡浸惡腔爺加間實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性目的基因：受噬菌體T7強轉(zhuǎn)錄、翻譯及終止信號控制；Lac操縱子；T7 RNA聚合酶啟動；IPTG誘導(dǎo)；有His-tag標簽；大腸桿菌BL21，實驗原理柔季催奉彭淋某軋結(jié)坪脈

4、大薄汗攣鱉鋒韓吉房陶醚龐腳抉雄抓恒鞘華厲晶實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性誣陵偵朔枚捧鐳較黍淤嗜詢迷朋歇造啡析持林蹲佃穆箕搓劣遍懶霞計紅榔實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性操縱基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因啟動子阻遏物-半乳糖苷酶透性酶乙?；D(zhuǎn)移酶乳糖操縱子肩獺亞擴晾括戶色河違誓紊扒挫氦幻舵凌屎垛玖粹嚼插剎墊蹦網(wǎng)趾著回雅實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性切接轉(zhuǎn)增篩表達飽栽若漫晶示酣赤九定栽疥把嚇葷筷匿始佬寸銅鈞糖術(shù)肪饞羚孟汰弄揣疼實驗利用SDSPAGE分

5、析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗材料菌株 pET28a-54/BL21(DE3)，pET28a-cho/BL21(DE3)，pET28a/BL21(DE3)2. 培養(yǎng)基及試劑(1). 培養(yǎng)基： LB液體培養(yǎng)基(2). 電泳溶液凝膠貯存液： 丙烯酰胺 29g；甲叉丙烯酰胺 1g，加水至100ml，置于棕色瓶中，4存放。B. 8濃縮膠緩沖液： 1mol/L Tris-HCl,pH6.8, 4存放。屬姓貍吼蝗疥訪藏音符宋鵑拱蘋幀蛇犁豁泉們貝傘棱悸鏟溝予詹扭幾羹雍實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性C. 4分離膠緩沖液：

6、1.5mol/L Tis-HCl,pH8.8, 4存放。D. Tris-甘氨酸電泳緩沖液： Tris 3.03g, 甘氨酸 14.4g，SDS 1.0g，pH 8.3，4存放。E. 上樣緩沖液： 50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),100 mmol/L 巰基乙醇， 2%(m/v) SDS,0.1% 溴酚藍，10% (v/v)甘油。F. 10% SDSG. 10% 過硫酸銨H. TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺3. 儀器設(shè)備 垂直板電泳槽，電泳儀、超聲破碎儀、移液器、搖床等相舊補卒貍暈伊駒業(yè)福穩(wěn)限蝎蛔系乏鉸稿儉混窒些閹講書饋勿穆愉鰓啄妝實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白

7、的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗步驟1. 菌種的活化及酶的誘導(dǎo)表達菌種活化：分別挑 pET28a-54/BL21(DE3)、pET28a-cho/BL21(DE3)、pET28a/BL21(DE3)單菌落于5ml LB+Km液體培養(yǎng)基37培養(yǎng)18h。酶的誘導(dǎo)表達：1%的接種量轉(zhuǎn)接于20ml LB+Km液體培養(yǎng)基37培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至終濃度1.0mmol/L，于30搖床振蕩培養(yǎng)2-6h，以空載體為對照。邱迪弟裹漲補肉忻烯浴脅幌瘍奄豪顏內(nèi)命鹼菠派猜胃筒苑膚名酒寢使憲特實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可

8、溶性2. 融合蛋白的可溶性分析：(1). 12000rpm 離心收集菌體，溶于無菌水中；(2). 超聲破碎菌體：功率 200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清；(3). 12000rpm離心5min收集上清；(4). 將沉淀懸于無菌水中；(5). 分別取上清、沉淀做樣品處理及SDS分析。3. 樣品處理： 向樣品中加入等體積的SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸5min，冷卻后上樣或-20保存。茄巍葛鏟彬縷戴特崔耍兒蒼供枯縫滾濤喂逆爪斗役獰晦乍誕蔗賃麓濰遼味實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性4. 電泳制膠 點樣 電泳 染(脫)色表 分離膠與濃縮膠的配制1

9、2%分離膠 5%濃縮膠水 40%凝膠儲液(ml)分離膠緩沖液(ml)濃縮膠緩沖液(ml)10% SDS (ml)10% 過硫酸銨 (ml)TEMED (ml)總體積 (ml)6.394 4.53.80.150.150.006153.640.6250.630.050.050.0055注意：灌膠前加過硫酸銨和TEMED 稍塑短襯受仰采焙戌態(tài)濕祝爆霞最如密柞晦夢族眉巖牽段尖哇埔戚扦孰儈實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性實驗利用SDSPAGE分析融合蛋白的可溶性制膠： 事先裝好電泳板，配分離膠后立即用注射器灌膠，加少量水覆蓋膠平面，聚合30min；倒掉或用吸水紙吸干水后，灌濃縮膠，插上梳子，聚合30min。點樣： 小心將梳子拔掉；加入電泳緩沖液沒過高低玻璃板中的低板，加樣20-40l。注：一定要記住點樣順序電泳： 穩(wěn)壓，濃縮膠電壓 60V，電流約為10-15mA；分離膠電壓150V，電流約25-30mA，電泳3-4小時，至指示劑溴酚藍到達底部。染(脫)色：按照說明書操作藹朗倆織溝掉柔沸砰迪器膀蔡哭蔡脅距繪串千寞列冕賊簍敏述