威尼德分子雜交儀：Western blot 實(shí)驗(yàn)介紹原理 方法步驟 試劑小結(jié)

1、威尼德分子雜交儀：Western blot實(shí)驗(yàn)原理及試驗(yàn)步驟威尼德生物科技(北京)，研發(fā)生產(chǎn)的：經(jīng)濟(jì)型分子雜交儀VH-1000、 多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000,底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓 周運(yùn)動(dòng)托盤，選配250ML/500ML錐形瓶托盤，96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如 放置雜交袋等其他嚴(yán)格要求的孵育實(shí)驗(yàn)，以及膜洗脫和凝膠脫色，同時(shí)可以做 恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室采用雜交技術(shù)的理想設(shè)備，可替代塑 料雜交袋和水浴搖床，并防止破損帶來的污染危害。經(jīng)典實(shí)驗(yàn)步驟是將提取的蛋白電泳轉(zhuǎn)膜抗孵育-二抗孵育一一一 底物顯色分析。我這幾天幾乎都在重復(fù)著這個(gè)過程，現(xiàn)在將自己試驗(yàn)

2、過程記 錄下來，和大家一起提供，希望對(duì)新手有所幫助。.蛋白提取傳統(tǒng)方法是(1)組織稱重(2)利用液氮、研缽粉碎組織塊(3)加入RIPA緩沖 液，PMSF(4)勻漿(15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘)維持4(5)加入PMSF冰上孵育30分 鐘，移入離心管4c離心15分鐘(6)上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20C保存。一 局部進(jìn)行Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積* 蛋白質(zhì)濃度)進(jìn)行電泳。小結(jié) 現(xiàn)在有許多公司提供即用的蛋白提取試劑或者試劑盒，如生興生物 代 理的Pierce系列產(chǎn)品，針對(duì)不同動(dòng)物組織、真核等蛋白的提取試劑盒，以及RIPA 緩沖液，PMSF等即用型試劑，免去了復(fù)

3、雜繁瑣的提取過程，高效方便。.蛋白電泳(SDS) SDS凝膠配制SDS凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用現(xiàn)成的SDS凝膠配制試劑盒（2）樣品處理在提供的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS蛋白上樣緩沖液（2X或5X 的）?？梢宰孕信渲?。（3）上樣與電泳這一步主要是要注意電泳的電壓選擇和蛋白標(biāo)準(zhǔn)的選擇，為了便于觀察電泳 效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。 3 轉(zhuǎn)膜具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要 的轉(zhuǎn)膜口寸間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。實(shí)驗(yàn)中常選用 PVDF膜和硝酸纖維素膜（NC膜），但硝酸纖維素膜比擬

4、脆，推薦使用PVDF膜。 轉(zhuǎn)膜的效果用麗春紅染色液或者考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的 SDS膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。小結(jié) PVDF膜 及Western轉(zhuǎn)膜液質(zhì)量都比擬好，染色液的染色結(jié)果清晰, 便于觀察結(jié)果，所以推薦在試驗(yàn)中使用。威尼德生物科技（北京），研發(fā)生產(chǎn)的:經(jīng)濟(jì)型分子雜交儀VH-1000、 多功能型分子雜交儀VH-4000、組合型分子雜交儀VH-2000,底部標(biāo)配培養(yǎng)皿圓 周運(yùn)動(dòng)托盤，選配250ML/500ML錐形瓶托盤，96孔酶標(biāo)板托盤，可適用于如 放置雜交袋等其他嚴(yán)格要求的孵育實(shí)驗(yàn)一以及膜洗脫和凝膠脫色，同時(shí)可以做 恒溫微生物培養(yǎng)。分子雜交儀是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室采用雜交技術(shù)的理

5、想設(shè)備，可替代塑 料雜交袋和水浴搖床，并防止破損帶來的污染危害。4.封閉這一步一定要保濕，防止膜的干燥，否那么極易產(chǎn)生較高的背景。加入Western 封閉液封閉（脫脂奶粉 或者BSA）。一般采用BSA或者脫脂奶粉，建議最好使用 BSA或?qū)Ｓ玫拿撝谭圻M(jìn)行封閉，雖然貴點(diǎn)，但還是有個(gè)好點(diǎn)的結(jié)果比擬好。 5. 一抗孵育參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western 一抗稀釋液稀釋一抗.二抗孵育參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物 酶（HRP）標(biāo)記的二抗。. Westernblot試劑盒顯色及蛋白檢測(cè)參考相關(guān)說明書，使用相應(yīng)的熒光檢測(cè)試劑等ECL類試劑來檢測(cè)蛋白。洗 片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑 盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。8.展的重復(fù)利用；=j如果蛋白樣品非常珍貴，可以使用Western 一抗二抗去除液處理蛋白膜，以 重復(fù)利用蛋白膜。9.分析比擬記錄主要試劑：丙烯酰胺和N, N。亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉SDS溶液、濃 縮膠緩沖液、TEMED原溶液、SDS加樣緩沖液、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、 轉(zhuǎn)移緩沖液、麗春紅染液儲(chǔ)存液、脫脂奶粉、NaN3 0.02%疊氮鈉、Tween20.一抗、標(biāo)記