基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性可修改版課件

1、基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性09.08.20221提 綱單核苷酸多態(tài)性Single Nucleotide Polymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性Gene Polymorphism and Genetic Susceptibility to Disease基因多態(tài)性與基因轉錄調(diào)控Gene Polymorphism and Regulation of Gene Transcription展望Future ProspectsDNA Structure基因突變基因突變（mutation)：由于DNA堿基對的置換、插入或缺失而引起的基因結構的變化，亦稱點突變。根據(jù)基因結構的改變方式，基

2、因突變可分為堿基置換突變和移碼突變兩種類型： 堿基置換突變：由一個錯誤的堿基對替代一個正確的堿基對的突變叫堿基置換突變。堿基替換過程只改變被替換堿基的那個密碼子，也就是說每一次堿基替換只改變一個密碼子，不會涉及到其他的密碼子。 移碼突變：基因中插入或者缺失一個或幾個堿基對，使DNA的閱讀框架（讀碼框）發(fā)生改變，導致插入或缺失部位之后的所有密碼子都跟著發(fā)生變化，結果產(chǎn)生一種異常的多肽鏈。 基因突變根據(jù)遺傳信息的改變方式，基因突變又可以分為同義突變、錯義突變和無義突變?nèi)N類型：同義突變：DNA的一個堿基對的改變并不會影響它所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這是因為改變后的密碼子和改變前的密碼子是簡并密碼

3、子，它們編碼同一種氨基酸，這種基因突變稱為同義突變。 錯義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯義突變。這種基因突變有可能使它所編碼的蛋白質(zhì)部分或完全失活。無義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子的基因突變叫無義突變。單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）：是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500-10

4、00個堿基對中就有1個，人類30億堿基中大約有1000萬個SNPs。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性可以只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transition，嘌呤嘌呤或嘧啶嘧啶)或顛換(transversion，嘌呤嘧啶)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。單核苷酸多態(tài)性理論上，SNPs可以分二、三和四等位基因，但人類一般為二等位基因（biallelic）。二等位基因有4種不同類型，包括1種轉換CT (GA)和3種顛換CA (GT)、CG (GC)、TA (AT)。四種SNPs類型在人類中的發(fā)生頻率不同，最常見的為CT (GA)轉換，約占2/3，其

5、它3種類型發(fā)生的頻率相同。之所以轉換幾率高，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。單核苷酸多態(tài)性Example of an SNP comprising a GA substitutionElectropherograms produced by fluorescence-based sequencing using an ABI 3700 showing the genomic DNA from an individual homozygous for G at the site of the SNP (

6、a) and an individual homozygous for A (b). The base substitution is denoted by an arrow.單核苷酸多態(tài)性人類基因組中大約估計每個基因有2個常見的錯義突變在公共數(shù)據(jù)庫中至少有500萬個SNPs。僅有少量（可能為50,000250,000）SNPs在一定程度上（小到中等度）能反映與疾病發(fā)生危險相關的表型。根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（Intergenic SNP

7、s，iSNPs）等三類。SNPs在基因組中的分布十分廣泛，但不同的區(qū)域出現(xiàn)的頻率不同。人類單堿基等位基因十分穩(wěn)定。人類SNPs大部分(85%)是共有的。單核苷酸多態(tài)性63% Intronic（內(nèi)含子） 24% Locus region（基因座區(qū)）11% Untranslated region（非翻譯區(qū)）1% Nonsynonymous（nsSNPs，錯義SNPs）1% Synonymous（同義SNPs）1% Splice site（剪接位點） 1, increased riskOR 1, protective effectQuestionnaire dataBiomarker assays研

8、究設計和統(tǒng)計分析以基于醫(yī)院的腫瘤病例對照研究為例病例：病人應為新診斷、病理學確診；未經(jīng)放療或化療；無腫瘤病史；無輸血史對照：無腫瘤者，可從醫(yī)療或保健機構中招募的，與病例無生物學上相關的醫(yī)療求助者或病人陪伴著。病例應與對照在年齡、性別、種族和吸煙狀況上在頻率上相匹配或采用個體匹配。正式的知情同意書、流行病學調(diào)查表和血液采集。統(tǒng)計分析：采用t檢驗、方差檢驗和多因素 logistic回歸分析等。研究設計和統(tǒng)計分析選定暴露于及未暴露于某因素的兩組人群，隨訪觀察一定的期間，比較兩組人群某種疾病的結局，從而判斷該因素與發(fā)病或死亡有無關聯(lián)及關聯(lián)大小的研究方法。特點屬于觀察法，需設立對照組。由“因”及“果”，

9、時序合理，檢驗暴露因素與疾病的因果聯(lián)系科學性強。最大優(yōu)點是可以獲取相對真實而可靠的資料。但是如果需要觀察大量人群，則花費太大。如果疾病的潛伏期很長，則需要觀察的時間很長。這些都會影響其可行性。用途檢驗病因假設：驗證某種暴露因素對某種疾病發(fā)病率或死亡率的影響，也可同時觀察某種暴露因素對人群健康的系統(tǒng)影響。描述疾病的自然史：疾病的自然發(fā)展過程，包括疾病的起病（病理發(fā)生期）、潛伏期(隱伏期)、臨床前期、臨床期到結局的全過程。前瞻性隊列（或群組）研究（Cohort Study)Susceptibility:Diet, Metabolism,DNA damage & RepairCarcinogenes

10、 CancerCancer-freeGenetic predisposition?(遺傳易患體質(zhì)？)Biomarkers for prevention and early detection?Cohort Study研究設計和統(tǒng)計分析又稱為單純病例研究（case only study） 或病例系列研究（case series study）。病例-病例研究是近年來被廣泛應用于疾病病因研究中評價基因與環(huán)境交互作用的一種方法，該方法僅通過某一疾病患者群體來評價基因型與環(huán)境暴露的交互作用，但不能評價二者各自的主效應。有時在一般病例對照研究中不易選擇合適的對照，特別是在分子流行病學研究中，從無疾病的對照

11、中去獲取某種生物標本也受到醫(yī)學倫理方面的制約。如果對一種疾病的兩個亞型進行對比研究，例如出血型腦卒中與缺血型腦卒中、p53突變陽性基因型的食管癌與p53突變陰性基因型的食管癌或者食管癌的鱗癌與腺癌的比較研究，可以不另外設對照組，而采取兩個亞組的直接比較。這種設計可以免除從無病的對照組收集資料特別是生物標本的麻煩，適用于研究兩組病因的差異部分，而其相同或近似的危險因素則將被掩蓋或低估。病例-病例研究（Case-Case Study）研究設計和統(tǒng)計分析應用的前提條件：在正常人群中基因型與環(huán)境暴露各自獨立發(fā)生，而且所研究的疾病為罕見病(此時可用OR來估計RR值)?；静襟E：確定某一患者群體作為研究對

12、象收集病人的一般情況、協(xié)變量、環(huán)境暴露資料，以及生物標本。采用分子生物學技術檢測基因型根據(jù)某一基因型的有無將研究對象分為類病例組和類對照組統(tǒng)計分析，計算OR值、P值。 判斷有無相乘模型的交互作用及顯著性意義。若有，進一步判斷為正相乘作用還是負相乘作用。 病例-病例研究（Case-Case Study）Blood Sample Processing and Biomarker Assay Flow ChartPHAPHASpinWhole blood short-term culture 1ml 1ml 1mlMutagen sensitivityassayBPDE ControlBPDEGam

13、ma 1mlBPDE-Induce DNA adducts assayDNAextraction 1mlRT- PCR forgene expressionLong-termstoragecDNADNA 1mlRNAextractionGenotypingLymphocyte isolation(frozen)CAT/LucassaysDNA repaircapacity2 mleachTransfectionHeparinized, 10-30 ml Sample collection(cases and controls)1mlPlasmaSerum 研究設計和統(tǒng)計分析相關性研究結果可重復

14、嗎？遺憾的是，大多數(shù)結果不能重復。假陽性報告（false-positive reports)：偽相關（spurious associations) 假陰性報告（false-negative reports）：該研究無足夠的效能來識別該相關性人群之間存在的差異（population differences）研究設計和統(tǒng)計分析在相關性研究結果缺乏一致性時，應采用何種可信度水平？大樣本(large sample size)避免出版偏差(avoid publication bias)種族分層(ethnic stratification)研究設計和統(tǒng)計分析影響相關性研究結果的因素：病因學上的復雜性 (e

15、tiological complexity)統(tǒng)計效能和采樣設計 (statistical power and sampling design)人群結構 (population structure)數(shù)據(jù)解釋 (data interpretation)研究設計和統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)解釋（Data Interpretation） 有幾種情況：顯著關聯(lián)、無重要關聯(lián)、無法決定。假陽性報告概率（false positive report probability，F(xiàn)PRP）有助于作出判斷FPRP取決于先驗概率（prior probability）、統(tǒng)計效能（statistical power）和效能指數(shù)（effec

16、t size）。統(tǒng)計效能：指當H0為錯時你正確地拒絕H0的概率（significance of the relationship under test）效能指數(shù)：是指被檢驗的兩變量之間關系的強度 (strength of the relationship under test）。兩者均與樣本大小有關。研究設計和統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)解釋（Data Interpretation）當先驗概率較高時，那么假陽性報告概率將較低，其關聯(lián)性將更趨正確。研究者必須選擇一個臨床或病因學上有意義的效能指數(shù)，如相對危險度（relative risk，RR）或比值比（odds ratio, OR） 以及先驗范圍。通常我們計算

17、并比較OR值及其95%可信限（95% confidence interval, 95% CI）。提 綱單核苷酸多態(tài)性Single Nucleotide Polymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性Gene Polymorphism and Genetic Susceptibility to Disease基因多態(tài)性與基因轉錄調(diào)控Gene Polymorphism and Regulation of Gene Transcription展望Future Prospects啟動子與基因轉錄Promoter RegionControl sites in DNA provide bindin

18、g sites for proteins; coding regions are expressed via the synthesis of RNA基本概念啟動子(promoter):位于結構基因5端上游的一段DNA序列指導全酶(holoenzyme)同模板正確結合活化RNA聚合酶啟動基因轉錄啟動子區(qū)(promoter region): RNA聚合酶(RNA polymerases)同啟動子結合的區(qū)域RNA聚合酶: 利用DNA模板合成RNA的酶RNA聚合酶的活性形式(全酶)為15S，由5種不同的多肽鏈構成，按分子量大小排列分別為(155000)，(151000)，(7000)，(36500)

19、和(11000)。每分子RNA聚合酶除有兩個亞基外，其余亞基均只有一個，故全酶為2(450000) 。全酶是指酶蛋白及其輔酶構成的有功能的復合物。 The function of RNA polymerase is to copy one strand of duplex DNA into RNA基本概念共有序列(consensus sequence)是指與真實序列相比，啟動子每個位置最常出現(xiàn)的理想化堿基序列。即將所有已知啟動子排列起來以求其最大相似性。一個序列如果為共有，則每一個特定堿基都理應在相應位置上有分布優(yōu)勢。大多數(shù)共有序列間的堿基差異不能超過1-2個。啟動子結構 有多種元件：TATA

20、框、GC框、CATT框、OCT等。結構不恒定：有的有多種框盒如組蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期轉錄蛋白。它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同。有的存在遠距離的調(diào)控元件，如增強子。這些元件常起到控制轉錄效率和選擇起始位點的作用。不直接和RNA聚合酶結合。轉錄時先和其它轉錄激活因子相結合，再和聚合酶結合。真核生物中有三種不同的RNA聚合酶，因此也有三種不同的啟動子，其中以啟動子最為復雜，它和原核的啟動子有很多不同：RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的轉錄起始位點，只有帶因子的全酶才能專一地同啟動子結合。RNA聚合酶沿著模板前進，直到終止子，轉錄產(chǎn)

21、生一條RNA鏈。通常把基因轉錄起點前面即5端的序列稱為上游(upstream)，起點后面即3端的序列稱為下游(downstream)。并把起點的位置記為+1，下游的核苷酸依次記為+2，+3，上游方向依次記為-1，-2，-3， 啟動子結構 啟動子結構在真核基因中，有少數(shù)基因沒有TATA框。沒有TATA框的真核基因啟動子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的則沒有GC框。GC框位于-80-110bp處的GCCACACCC或GGGCGGG序列。TATA框的主要作用是使轉錄精確地起始；CAAT框和GC框則主要是控制轉錄起始的頻率，特別是CAAT框對轉錄起始頻率的作用更大。在真核生物中，在轉錄起始位點上

22、游70-80bp處有CAAT順序，也稱為CAAT盒，是比較保守的共有序列：GCCTCAATCT。DNA-蛋白質(zhì)結合研究策略背景基因轉錄實際上是RNA聚合酶、轉錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結果。在基因表達的調(diào)控中，轉錄的起始是關鍵。常常某個基因是否應當表達決定于在特定的啟動子起始過程。啟動子區(qū)DNA結合蛋白作為轉錄調(diào)控因子，通過與啟動子DNA結合以調(diào)節(jié)基因轉錄。猶如抗原-抗體特異性結合一樣，蛋白質(zhì)與DNA的結合也是特異的，這是研究啟動子區(qū)DNA結合蛋白的前提。DNA-binding and activating functions in a transcription factor

23、 may comprise independent domains of the protein研究方案細胞內(nèi)法(in vivo):以已知啟動子DNA序列篩選出與其相結合的蛋白編碼基因, 通過生物信息分析來確定該蛋白質(zhì)的名稱。優(yōu)點：更符合生理狀態(tài)，操作簡便，適合大通量篩選，用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)。 缺點：一是只能篩選可與啟動子DNA特異性結合的蛋白質(zhì)，但不能檢查出精確的蛋白質(zhì)結合位點；二是特異性略差。 常用的有酵母單雜交(Yeast one hybrid)技術、噬菌體表面展示(Phage display)技術等。 研究方案細胞外法(in vitro)：即在體外用重組的已知蛋白質(zhì)與啟動子DNA

24、結合。優(yōu)點：特異性好，且能夠在啟動子DNA序列上找到精確的蛋白質(zhì)結合位點。缺點：效率低，操作復雜，一般不用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)。常用的有EMSA (electrophoretic mobility-shift assay)、DNase I foot-printing assay等。 凝膠遷移率變動試驗(EMSA)基本原理為：在凝膠電泳中，由于電場的作用，小分子DNA片段比其結合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽極移動的速度快。若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結合，則其向陽極移動的速度受到阻滯，在凝膠放射性自顯影上或生物素標記，就可找到DNA結合蛋白。超級EMSA超級EMSA，即Super-shift ass

25、ay, 是EMSA試驗的改進，將DNA與更多的蛋白結合，這樣，與特異性蛋白結合的目的DNA移動速度進一步減慢。由于凝膠遷移率變動試驗的特異性好，常用來鑒定其它方法篩選出的結果。顯而易見，克隆啟動子DNA片段并標記，用該實驗就可找到相應的結合蛋白。EMSA優(yōu)缺點優(yōu)點：簡單、快速、敏感缺點:需已知目標DNA序列DNA序列較短, 一般為20-30個核苷酸。體外（非體內(nèi)）檢測方法EMSA原理(a) The binding site of interest is synthesized as a short radiolabelled DNA probe which can be used to ide

26、ntify both known and novel factors binding to the candidate region. Once bound to DNA, a proteinDNA complex is stabilized when subjected to non-denaturing PAGE, allowing resolution of proteinDNA complexes as discrete bands. (b) The specificity of the interaction may be investigated by competition ex

27、periments in which typically 10- or 100-fold excess unlabelled probe is added, which, in the case of a specific competitor probe, results in progressively less radiolabelled probe bound by the transcription factor protein.DNase I 足跡試驗足跡試驗（foot-printing assay）不僅能找到與特異性DNA結合的目標蛋白，而且能告知目標蛋白結合的堿基部位。足跡試驗

28、的方法較多，常用的有DNase I 足跡試驗、硫酸二甲酯(dimethylsulfate, DMS)足跡試驗，二者原理基本相同?；驹恚旱鞍捉Y合在DNA片段上，保護結合部位不被DNase I破壞，這樣，蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應于蛋白質(zhì)結合的部位沒有放射性標記條帶。Principle of the DNase I foot-printing assay(含乳糖操縱子DNA)(乳糖阻遏物)Principle of the DNaseI foot-printing assayDNase I 足跡試驗技術流程：1. 標記探針：待檢雙鏈DNA分子用32P

29、作末端標記，通常只標記一端。2. 結合和消化：蛋白質(zhì)與DNA混合，待二者結合后，加入適量的DNase I以消化DNA分子，控制酶的用量，使之達到每個DNA分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，同時設未加蛋白質(zhì)的對照。3. 電泳和顯影：從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA加樣在測序凝膠中作電泳和放射性自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。啟動子區(qū)SNPs的功能研究背景編碼DNA (Coding DNA)：外顯子(exons) 氨基酸改變或轉錄mRNA非編碼DNA (Non-coding DNA)：啟動子(promoter)、 內(nèi)含子( introns)、 5-非翻譯區(qū)(5-UTR)、3-非翻

30、譯區(qū)(3-UTR) 基因表達(假定的調(diào)控區(qū)，putative regulatory regions) 轉錄(啟動子區(qū))背景如果SNPs發(fā)生在DNA編碼區(qū)，可引起翻譯蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生改變，即使是同義突變 (synonymous mutation)，該SNPs的功能效應也可在mRNA水平檢出。如果SNPs發(fā)生在非編碼區(qū)，特別是基因上游的啟動子區(qū)，則可能影響基因的轉錄過程。如果SNPs位于某轉錄因子的共有序列中，將可能改變該轉錄因子與DNA結合的親和性(affinity), 或引入一個新的因子與DNA結合，從而可能改變該基因轉錄過程的特異性和動力學特征。發(fā)生在非編碼區(qū)的SNPs的功能效應難以直接檢

31、出，必須通過諸如轉錄活性試驗等手段間接檢測。轉錄起始位點基因的啟動子區(qū)域中含有許多重要的調(diào)控基因轉錄的DNA序列（順式元件），若要闡明基因在轉錄水平上的調(diào)控機制（包括啟動子區(qū)SNPs功能研究），克隆啟動子序列是必不可缺的關鍵一環(huán)。到目前為止，已闡明啟動子序列以及它們的調(diào)控機制的基因數(shù)量非常有限。標準的真核生物有關的啟動子數(shù)據(jù)庫Eukaryotic Promoter Database中登錄的基因啟動子也不過數(shù)百個，其中一個重要原因之一是許多基因未能確切的確定轉錄起始位點。 轉錄起始位點理想的克隆cDNA應包含模板mRNA的5帽的結構以及3多聚A尾的全長序列。傳統(tǒng)的方法克隆的cDNA，多數(shù)情況下其

32、5末端為部分缺失狀態(tài)。究其原因有二：一是在以mRNA模板進行逆轉錄過程中，逆轉錄酶在從模板mRNA中脫落，只能得到部分拷貝的cDNA產(chǎn)物。二是在進行逆轉錄過程中，用了部分5末端被降解的mRNA為模板合成cDNA。因此，在構建cDNA文庫中得到的多數(shù)是5末端部分缺失狀態(tài)的cDNA。換言之，在構建cDNA文庫的過程中，應用逆轉錄酶以及應用極易受降解的mRNA是不可避免的，因此5末端部分缺失就不足為奇了。 轉錄起始位點S1核酸酶作圖法、引物延伸法(RT)、5-RACE (rapid amplification of cDNA ends)法等傳統(tǒng)的轉錄位點的確定方法，技術要求比較高，且有時由于種種原因

33、，難以確定確切的轉錄起始位點。隨著生物信息學（Bioinformatics)的發(fā)展，網(wǎng)上的相關數(shù)據(jù)庫逐漸豐富，這為轉錄起始位點的研究提供了一個新的思路。最近，由日本鈴木等開發(fā)的寡核苷酸帽法(Oligo caping method)構建的cDNA文庫中，隨機的克隆全長的cDNA，適合于大規(guī)模、精確的獲得基因轉錄起始位點的信息 (Suzuki Y, 2002) 。生物信息學方法大體步驟獲取基因轉錄本信息：尋找盡可能長的5端cDNA基因CpG島分析：采用網(wǎng)絡在線軟件，綜合評價有關CpG島、轉錄起始位點以及預計起始位點下游的信息，對基因轉錄起始作出預測。啟動子區(qū)域預測生物信息學方法常見的網(wǎng)上在線生物信

34、息學軟件：/molbio/proscan/index.html/molbio/signal/index.html/pub/programs/alibaba2/software/proscan/promoterscan.htm/cgi-bin/tess/tess/index.html?org=Human&db=hg17&hgsid=41271104http:/www.cephb.fr/生物信息學方法實驗流程構建質(zhì)粒：根據(jù)生物信息學分析結果，構建5和3缺失片段作為候選啟動子區(qū)域，設計引物。以正常人基因組DNA為模板，用PCR法擴增各片段，酶切后連入基本載體中。轉染細胞：分別設立陰性、陽性和內(nèi)對照。

35、測定轉錄活性確定其轉錄起始位點寡核苷酸帽法（Oligo Caping Approach） 傳統(tǒng)的cDNA克隆化技術的缺點 寡核苷酸帽法（Oligo Caping Approach）全長cDNA的克隆 寡核苷酸帽法（Oligo Caping Approach）全長cDNA文庫的構建 啟動子區(qū)SNPs功能研究方法DNA-蛋白結合體外檢測（In vitro）凝膠遷移率變動試驗（EMSA）DNase I 足跡試驗瞬時轉染（Transient transfection） CAT assayLuciferase assay體內(nèi)測定其功能（In vivo）采用具有不同基因型和與表型相關的細胞基因組足跡試驗：

36、硫酸二甲酯（dimethylsulfate，DMS）、哌啶裂解（piperidine cleavage）染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation）啟動子區(qū)SNPs功能研究步驟確定轉錄起始位點（一般位于第一外顯子）：采用引物延伸法（primer extension, RT）、S1 mapping、生物信息學及寡核苷酸帽法等方法。DNA片段功能測定：報告基因方法，測定報告基因(Luciferase)活性。DNA-蛋白質(zhì)交互作用檢測：采用EMSA和super-gel shift 方法SNPs對基因表達功能檢測：瞬時轉染試驗體外轉錄：采用無細胞系統(tǒng)(cell-free

37、 system)Recombinant Plasmid DNA Expression Vectors Used in the Host-Cell Reactivation Assay4863 bp ApEnhPLucBgl II Xbal IPvu I BamH I Nar I Bgl II pCMVlucpCMVcat5000 bp ApEnhPCatHind IIIXbal IEcoR I EcoR I 實例：TNF多態(tài)性的功能分析The Structure of Promoter RegionThe TNF promoter region containing multiple transcription factor-binding sites, most lie in the first 200ntStrategic ApproachMapping out potent