酶免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1、、酶免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)1、標(biāo)本固定：固定的目的是防止標(biāo)本從玻片上脫落；除去防礙抗原抗體結(jié)合的類脂， 使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；固定的標(biāo)本易于保存。2、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、 切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。3、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以 先60度20min，然后立即二甲苯1-3分別10min，但當(dāng)天制好的切片可以60度3-4h。水化 用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異 性背景著色。4、抗原修復(fù)：由于組織中部分抗原在甲

2、醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及 醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高 抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修 復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。我們實驗 室一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（只要 你覺得修復(fù)液的溫度達室溫即可）。5、細胞通透：目的是使抗體能夠充分地進入胞內(nèi)進行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、蛋白 酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體

3、及 大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進入胞漿和胞核內(nèi)，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順 利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（10um厚切片）和免疫細胞化學(xué)中一般用 Triton X-100作為細胞通透劑，在膜上打孔。6、滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素：在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易 收到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。滅活內(nèi)源性 POD 一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右，而0。3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長 封閉時間，一般1030min；用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定 組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引

4、起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。不過，現(xiàn) 在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾，推薦使用。7、血清封閉：組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性； 封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的 位點發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫或 37 度 10-30min。8、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間和 抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與 溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h

5、，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體 條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃 度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤?時間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。9、抗體稀釋液：其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除 PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。 正因為這種原因，我一直用國產(chǎn)的專用抗體稀釋液，一段時間在更換新抗體稀釋液時實驗結(jié) 果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒有結(jié)合），最后從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原

6、因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié) 果。10、切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色， 所以適當(dāng)?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是注意：（1）單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用 浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS的PH和離子強度 的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見 特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫

7、 復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子 強度則有利于分解）11、DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色 時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強而本底著色較淺時 即可沖洗；DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你 的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；此外， 若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間； DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過

8、低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。12、復(fù)染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞 核染料）。注意蘇木素復(fù)染時間要看當(dāng)時的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一 般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時間長一點，而胞核蛋白則要短。不過這個如果染色不 理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。 鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù) 秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。13、封片：為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方

9、法是直接在載玻 片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封 片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以 緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。二、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干 凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。2、組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時 間保存的白片，一定要及時固定和適當(dāng)保存。3、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二 抗來

10、源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般10-30min。4、一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有 幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工 作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛?和孵育時間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時 間的延長，可能后有大量

11、的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當(dāng)?shù)碾x心。6、復(fù)染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進行定位。一般常用DAPI復(fù)染。7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。 避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而 另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn) 液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌娗逑?后的清洗均為5次*5min。注意（1）單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)

12、造成污染。（2）溫柔沖洗， 防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時我買的抗體稀釋液 偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼 性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于 免疫復(fù)合物的形成，而高離子強度則有利于分解）9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持 避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意 改變程序；應(yīng)在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡； 檢查時間每次以12h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本 受紫外線照射35min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰 減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過23h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以 節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈