克隆載體課件

1、基因克隆載體DNA克隆載體或基因克隆載體：將外源DNA帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子DNA克隆載體必須具備的主要條件:(1)至少有一個多克隆位點(MCS)，供外源基 因插入(2)自我復制(3)具有可選擇的標記基因(4)安全，不含有害基因第1節(jié) 質粒克隆載體一.質粒的性質 1.質粒組成與構型 質粒:染色體外裸露的雙鏈DNA分子 廣泛存在于細菌，在真菌、藍藻、綠 藻中也有發(fā)現(xiàn) 大腸桿菌質粒特性分:F型、S型、Col型 構型:超螺旋共價閉環(huán)(ccc-DNA)、開環(huán) (oc-DNA)、線形(l-DNA)2.質粒的大小 100kb 相當于染色體大小的3%4.質粒DNA的復制質粒復制考貝數(shù)控制

2、原理:Cop基因編碼阻遏蛋白，結合復制起始位點a.嚴緊型(stringent plasmid): 拷貝數(shù)少(1到幾個)b.松弛型(relaxed plasmid):拷貝數(shù)較多(10個以上)松弛型質粒施加氯霉素可大量擴增質粒 氯霉素抑制蛋白合成，影響了基因組 DNA的合成5.質粒的不親合性: 親緣關系較近的質粒一般不親合 解釋1: inc基因合成質粒復制阻遏物 解釋2: 膜結合位點飽和6.質粒遷移結合質粒(conjugative plasmid) 含有tra基因，指令宿主形成菌毛(pilus) 如: 質粒F、Ti、ColV2和IncP等非結合質粒(non-conjugative plasmid)

3、 本身不含tra，不會自行結合轉移 如：質粒ColE1、pPbS等遷移作用(molilization): 有些非結合質粒，本身含有bom(oriT)位點, 當同時存在mob基因(或存在于輔助質粒上)，借助于tra基因產(chǎn)物，使非結合質粒轉移到受體菌中7.顯性質粒和隱蔽質粒顯性質粒:R:抗抗菌素的質粒 Ap或Amp、Cm或Cmp、Km或Kan、Tc或TetF:引起細胞結合的育性質粒Col:產(chǎn)生大腸肝菌素(colicins)的質粒Ti:致植物冠癭瘤的質粒二. 構建克隆載體的基本策略(1)具有有效的復制起始位點(Ori) 松弛型最好(2)多克隆位點(MCS)(3)標記基因(4)DNA分子盡可能小(5)

4、可組裝特殊元件 表達型(帶有啟動、終止序列)、 同源重組型三.質?？寺≥d體的構建1.大腸桿菌質?？寺≥d體pBR322來源: 由質粒ColE1衍生的pMB1為出發(fā)質粒pMB1的特點:含有ColE1的松弛型復制起始位點缺少好的選擇標記基因缺少較好的克隆位點pBR322的構建(1)保留ColE1的松弛型復制起始位點(2)pSF124中Apr(3)pSC101中Tcr 在抗性基因中帶入合適的酶切位點(4)缺失遷移蛋白mob基因，但保留了bom位點pUC18/19pBR322的Tcr被乳糖操縱子一段DNA取代啟動子、調節(jié)因子、-半乳糖苷酶的-肽基因(lacZ)-改造含MCS藍白斑篩選(互補)LacZ基因

5、的調控序列和頭146個氨基酸的編碼信息，編碼-互補肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內互補（ -互補） IPTG(異丙基-D硫代半乳糖苷)誘導下，作用底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷) ,使菌落呈藍色2.農(nóng)桿菌Ti質粒克隆載體構建Ti質粒(tumer inducing plamid):根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)含有的一種質粒，當農(nóng)桿菌與植物接觸時，會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤(冠癭瘤)雙鏈DNA分子，大小在200-250kbp之間根據(jù)其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)

6、、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型（agropine）、農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)Ti質粒可分為四個區(qū):(1)T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions）： T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段 DNA，稱為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。約25kbp。 T-DNA左右邊界(LB、RB)：25bp正向重復序列 右邊界（TR）序列更為保守，左邊界(TL)序列在某些情況下有 所變化。其核 心部分是14bp，可分為10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA

7、)兩部分,是完全保守的。 內部為:ocs、nos、引發(fā)腫瘤相關基因(Onc基因)(2)Vir區(qū)（virulence region） 該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為 毒區(qū)。 T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質粒DNA的三分之一。(3)Con區(qū)（regions encoding conjugations） 該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質粒在農(nóng)桿菌之 間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。(4)Ori區(qū)（origin of replication） 該區(qū)段基因調控Ti質粒的

8、自我復制，故稱之為復制起始區(qū)。雙元載體系統(tǒng)（binary vecter） ：由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒系統(tǒng),又因為其T-DNA與Vir基因在兩個獨立的質粒上，通過反式激活T-DNA轉移,故稱之為反式載體（trans vecter）雙元載體系統(tǒng)的構建原理(1)雙元載體主要包括兩個Ti質粒，即微型Ti 質粒和輔助Ti質粒(2)Ti質粒上的Vir基因與T-DNA具有反式互 補作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的 轉移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍 質粒的復制起始點（oriV），而代替了共 整合載體中用以重組的同源區(qū)，能夠在任 何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復制。TA克

9、隆載體第2節(jié) 病毒(噬菌體)克隆載體病毒：DNA（或RNA）和外殼蛋白噬菌體：感染細菌的病毒病毒與宿主關系來分：溫和型病毒構建載體的好材料烈性病毒通過改造，也可用于構建載體一. 噬菌體溶源性細菌特點：超感染免疫性溶原性細菌誘發(fā)進入溶菌周期att位點 attL attR噬菌體插入大腸桿菌基因組方式Champbell模型噬菌體粘末端結合成的雙鏈稱為Cos位點構建噬菌體的基本策略與技術路線：(1)去除非必須區(qū) 噬菌體包裝: 大小51-36.4kb之間 野生型大小為48.5kb 去除非必須片斷(復制、裂解等非必須)， 使包裝片斷盡可能大 同時，抹去一些酶切位點插入型載體 替代型載體 gtWESB替換型

10、： 最大可達15.5 最小0.7kb插入型： 不大于10.6kb(2)標記基因 Spi- ：外源取代red、gam基因 lacZ基因: 藍白斑(3)建立外包裝系統(tǒng) 轉染(transfection)：裸露DNA 轉導(transduction)：包裝后，噬菌體顆粒介導宿主細胞中噬菌體的包裝過程頭部:E蛋白占72%：頭部主要組成成分 琥珀突變導致尾部蛋白積累D蛋白占20%: DNA進入頭部前體以及頭部 成熟作用 琥珀突變導致頭部蛋白積累D基因缺失突變株(D-): 溶原菌菌株BHB2690E基因缺失突變株(E-) 溶原菌菌株BHB2688 噬菌體克隆載體的應用(1)構建cDNA文庫(2)克隆外源目的

11、基因二.粘粒(cosmid)噬菌體克隆外源DNA能力，最大23kbp，較為有效的克隆為15kbp在研究基因組功能時，需要更大克隆能力的載體，于是，提出cosmid粘粒定義:包含噬菌體cos位點的質粒，因此，質粒DNA在體內可以被噬菌體衣殼蛋白包裹。包含cos兩端280bp以上的序列以及包裝相關序列。剩余部分為質粒，具有質粒的性質。進行有效包裝，插入片斷后，總大小要在36.4-51bp之間粘粒的特點:(1)具有部分噬菌體特點 體外包裝后，高效轉導敏感型大腸細胞， 進入后環(huán)化(2)具有質粒特點 復制、抗性(3)高容量克隆能力 極限可達45kbp噬菌體包裝必備條件:cos位點末端酶(teminase

12、)第3節(jié) 染色體定位整合載體染色體定位整合平臺系統(tǒng)(gene integration platform system)整合平臺：外源DNA整合位置克隆載體: 除一般質粒特征外，具有與整合 平臺同源的DNA序列 基因打靶(gene targeting)基因定點同源重組(site-specifichomologus recombination)定位整合克隆載體的幾種模式:(1)內源平臺雙交換置換克隆載體(2)外源平臺雙交換置換克隆載體(3)內源平臺雙交換插入克隆載體(4)內源平臺單交換插入克隆載體定位整合克隆載體的定位整合效率(1)受體細胞(2)同源DNA片斷長短總體上整合效率偏低第4節(jié) 人工染色

13、體克隆載體大片段克隆載體 顯著特點是載體的容載能力擴大,約100350kb,主要有:酵母人工染色(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)源于噬菌體P1的染色體(Pl2derivedartificialchromosome,PAC) 酵母人工染色體(YAC)YAC 載體的復制元件是其核心組成成分:大腸桿菌中復制起始位點(ori)其在酵母中復制的必需元件包括復制起點序列即自主復制序列（autonomously replicating sequence， ARS）用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲

14、粒 （centromere , CEN）兩個端粒（TEL） 篩選主要是營養(yǎng)缺陷型YAC載體的突出特點是容載能力大動物的YAC文庫平均插入長度達9001000kb植物YAC文庫平均插入片段一般為100350kb 構建基因組文庫時,只需要較少的克隆數(shù)便可以覆蓋整個基因組,使構建高等生物基因組遺傳圖譜和物理圖譜成為可能,基因組計劃得以順利實施。 缺點: (1)存在嵌合現(xiàn)象(chimerism)(2)YAC克隆的穩(wěn)定性差 (3)插入片段的分離和純化困難 (4)轉化效率低 細菌人工染色體(BAC)在大腸桿菌F因子的基礎上發(fā)展而來的, 其復制是嚴謹型的,在每個細胞中僅有12個拷貝,減小了插入片段發(fā)生重組的機率,并且F因子能夠攜帶1