醫(yī)學專題藥敏試驗

1、2021/7/20 星期二1抗菌藥物的敏感試驗 張德純 教授 病原生物學教研室2021/7/20 星期二2 醫(yī)院感染近年來已成為全球性的突出問題，其主要原因之一是抗菌藥物的使用不當促進耐藥菌在病人體內(nèi)和醫(yī)院環(huán)境中定植繁衍，進而導致的交叉感染和內(nèi)源性感染日益增多。合理使用抗菌藥物的前提之一是要重視感染病原學的實驗室診斷和監(jiān)控抗感染治療的實驗室服務。為臨床抗感染治療的藥物選擇以及療效的監(jiān)測和考核提供實驗室依據(jù)是臨床微生物實驗室的重要職能之一。2021/7/20 星期二3 藥物敏感試驗包括體外抗菌藥物敏感試驗、體內(nèi)抗菌藥物活性的測定和藥物濃度的測定。 體外抗菌藥物敏感試驗包括抑菌試驗、殺菌試驗、聯(lián)合

2、藥敏試驗和檢測細菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶。常用的體外抗菌藥物敏感試驗有紙片擴散法、稀釋法和E試驗法。 本章僅對臨床微生物實驗室常用的體外藥敏試驗的基本原理和方法進行介紹。2021/7/20 星期二4一、臨床常用的抗菌藥物 抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學合成藥物。1. 青霉素類抗生素2.頭孢菌素類抗生素3.其他-內(nèi)酰胺類抗生素4.氨基糖甙類抗生素5.喹諾酮類抗生素6.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素7.四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素8.糖肽類抗生素9.磺胺類藥物及增效劑10. 其他合成抗菌藥2021/7/20 星期二5二、抗菌藥物敏感性試驗（一）抗菌藥物敏感性試驗的意義 抗菌藥物敏感性試驗（anti

3、microbial susceptibility test ,AST）意義在于：1. 可預測抗菌治療的效果，既AST試驗結(jié)果為“敏感”時，治療可能有效；試驗結(jié)果為“耐藥”時，使用該藥物治療肯定失?。?. 指導臨床醫(yī)生選擇使用抗生素，AST的結(jié)果往往在給予病人經(jīng)驗性治療2448h之后，若AST結(jié)果為“敏感”，該治療為有效，若結(jié)果為“耐藥”，即應更換藥物；2021/7/20 星期二63. 提供所選擇藥物的依據(jù)；4. 監(jiān)測耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染病的流行病學，控制和預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。2021/7/20 星期二7（二）藥敏試驗方法 1 紙片擴散法1）K-B紙片瓊脂擴散法（1）

4、原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含有的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度。并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關(guān)關(guān)系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。2021/7/20 星期二82.抗菌藥物紙片：選擇直徑6.35mm的新華濾紙含藥物紙片，-20保存。3.培養(yǎng)基：用水解酪蛋白（Mueller-Hinton MH）瓊脂。瓊脂厚度4mm。9cm內(nèi)徑的平板需傾注25-30ml瓊脂，7cm內(nèi)徑的平板需傾注15 ml瓊脂。

5、對于營養(yǎng)要求高的細菌在MH瓊脂基礎(chǔ)上加入血清或血液。2021/7/20 星期二94. 操作步驟： 接種 在已分純的待測菌平板上挑取45個菌落 35 46 h35mlMH肉湯中 用肉湯調(diào)整菌液至 15min 內(nèi) 0.5個麥氏管（1.5108/ml） 用無菌 棉簽均勻涂布平板（涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60 度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周） 室溫5分鐘后 貼紙片（各紙片中心相距應大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應大于15mm） 35 16-18h 觀察結(jié)果2021/7/20 星期二10 5. 結(jié)果判斷：量取抑菌圈直徑 抗菌藥物敏感性標準分為以下三級：敏感：表示測試菌能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達到的血藥濃

6、度所抑制或殺滅。中度敏感(中介)：指測試菌可被測定藥物大劑量給藥后在體內(nèi)能達到的濃度所抑制，或在測定藥物濃集部位的體液中，如尿中被抑制。 耐藥：表示測試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制。 2021/7/20 星期二116.影響因素（1）培養(yǎng)基的質(zhì)量，如PH、深度、硬度和表面濕度等；（2）藥敏紙片的質(zhì)量，含藥量和保存方式；（3）接種菌量正確與否是影響結(jié)果的重要因素之一，取決于比濁標準的配制，正確使用和保存；（4）試驗操作質(zhì)量：接種細菌后貼片時515分鐘； （5）孵育條件，溫度和時間：培養(yǎng)時間 1618h,不要超過24h。 7. 質(zhì)量控制 采用標準菌株：金黃色葡萄球ATCC259

7、23，大腸埃希菌ATCC25922，和銅綠假單胞菌 ATCC278532021/7/20 星期二122）直接紙片藥敏法 由確證感染部位采集到的一些重要臨床標本直接涂布接種MH瓊脂或5%羊血MH瓊脂，然后放置藥敏紙片。不僅可提早24h得出初步藥敏結(jié)果供臨床用藥參考，還有助于發(fā)現(xiàn)混合感染中的不同菌種、耐藥菌株以及病原菌的鑒定。但由于此法難以控制接種菌量，且標本中可能存在多種細菌，因此還需要在病原菌分純后再用KB法對其進行驗證和補充。2021/7/20 星期二13 2 稀釋法 1） 肉湯稀釋法 包括試管稀釋法和微量稀釋法。下面重點講述試管稀釋法（常量稀釋法）。 （1）.原理：以水解酪蛋白（MH）液體

8、培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后種入待測細菌，定量測定抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度（MBC）。 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）：細菌生長被完全抑制的最低藥物濃度為該藥對測試菌的MIC。 最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration,MBC）：某抗菌藥物能殺滅99.9%以上測試菌時的最低藥物濃度。2021/7/20 星期二14試管編號：抗生素： 2ml(512g/ml)MH肉湯抗生素含量菌液(ml)：（1.5107 /ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101ml

9、1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 256 128 64 32 16 8 4 2 1- 不加抗生素0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml1ml(棄去 )對倍稀釋：(2) 方法2021/7/20 星期二15注意 :設立對照管(肉湯對照管,待測菌生長對照管和質(zhì)控菌生長對照管.（3）結(jié)果判斷: 不出現(xiàn)肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對該細菌的MIC.如第六管不出現(xiàn)肉眼可見生長,則MIC=原藥物濃度(512 g/ml) 稀釋倍數(shù)(1:32)=16 g/ml

10、 將所有無菌生長的試管轉(zhuǎn)移到血平板，培養(yǎng)過夜，平板上無菌落生長的最低藥物濃度為藥對該菌的MBC.混勻35 1620h 觀察結(jié)果2021/7/20 星期二16 （4）影響因素：培養(yǎng)基、接種菌量、蛋白質(zhì)結(jié)合率、抗菌藥物的配制、結(jié)果觀察的時間等因素均能影響本試驗的結(jié)果。 （5）質(zhì)量控制：每批或每次實驗時應根據(jù)測試菌種類分別選用金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在同一試驗條件下進行測定。2021/7/20 星期二172）瓊脂稀釋法（1）原理： 將藥物混勻于MH瓊脂平板上， 配制含不同濃度藥物平板，使用多頭

11、接種器接種細菌，經(jīng)孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含的藥物濃度測 得MIC。 （2）方法： 將0.5麥氏管菌液稀釋10倍以多頭接種器接種于瓊脂表面，稀釋的菌液15min內(nèi)接種完畢，置35孵育1620h。 （3）質(zhì)量控制：原則同肉湯稀釋法，每個瓊脂平板應同時接種標準菌株。2021/7/20 星期二18 3 E試驗 E試驗是一種結(jié)合稀釋法和擴散法原理對微生物藥敏試驗直接定量的技術(shù)。 （1）原理 E試條是一條5mm50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長的稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。 將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明

12、顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度，又稱抑制濃度（IC），它與MIC呈高度相關(guān)。 2021/7/20 星期二19（2）方法 菌液、平板接種等同紙片瓊脂擴散法,待瓊脂平板完全干燥，用E試驗加樣器或鑷子將試條放在已接種細菌的平板表面，試條全長應與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。 采用NCCLS2002 AST執(zhí)行標準推薦孵育條件。 （3）結(jié)果判讀：讀取橢圓環(huán)與E試驗試條的交界點IC值。2021/7/20 星期二20 E試驗2021/7/20 星期二21細菌生長區(qū)抑菌圈含藥試條最低抑菌濃度2021/7/20 星期二22 4 聯(lián)合

13、藥物敏感試驗（1）聯(lián)合藥敏試驗的方法 聯(lián)合藥敏試驗的方法很多，其中紙片法最為常用。下面就介紹紙片法的試驗方法。 與紙片擴散法類似。先將試驗菌均勻涂布于培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，放置5分鐘，待平板表面水分吸收后，將兩種含藥紙片貼于平板上，兩紙片中心距離2-4mm左右。然后35 孵育過夜，取出觀察結(jié)果。2021/7/20 星期二232）結(jié)果判斷聯(lián)合藥物敏感試驗可出現(xiàn)四種結(jié)果：A.無關(guān)作用： 甲+乙=甲單或乙單B.拮抗作用： 甲+乙甲單或乙單C.相加作用： 甲+乙=甲單+乙單D.協(xié)同作用： 甲+乙甲單+乙單2021/7/20 星期二24A.無關(guān)作用： 甲+乙=甲單或乙單細菌對兩藥均耐藥細菌對甲耐藥對乙敏感細菌對兩藥均敏感，抑菌環(huán)交界角尖銳。2021/7/20 星期二25B.拮抗作用： 甲+乙甲單或乙單細菌對甲藥耐藥，對乙藥敏感，甲藥對乙藥發(fā)生切割狀拮抗現(xiàn)象。細菌對甲乙兩藥均敏感，乙藥對甲藥發(fā)生扇圓形拮抗現(xiàn)象。細菌對甲乙兩藥均敏感，甲乙兩藥發(fā)生相互切割狀拮抗現(xiàn)象。2021/7/20 星期二26