實驗一微生物拮抗作用

1、.：.；講義實驗一 枯草芽孢桿菌對棉花黃萎病的拮抗作用 實驗?zāi)康模?進一步掌握無菌操作技術(shù)，加深對微生物之間互作的進一步認識 實驗原理： 枯草芽孢桿菌分泌到體外的帶謝產(chǎn)物可以抑制棉花黃萎病的生長 供試菌株 (1) 拮抗菌株: 枯草芽孢桿菌冰箱保管(2) 病原菌株: 棉花黃萎病菌冰箱保管 實驗步驟1. 培育基的制造PD培育液：(2) PDA培育基：查氏培育液：按上述配方配制查氏液體50 ml及固體膠培育基125 ml分別裝在250的三角瓶中，121 條件下滅菌30分鐘。2. 接種培育(1) 在無菌操作條件下，將棉花黃萎病菌接種在查氏培育液中，28振蕩培育4天。(2) 將枯草芽孢桿菌在PD培育液中

2、28培育24小時3. 抑菌實驗(1) 平板制備：將固體PDA培育基溶化后倒入培育皿中，制成平板(2) 棉花黃萎病菌液涂皿：將棉花黃萎病菌液用玻棒均勻的涂布在查氏平板培育基上(3) 枯草芽孢菌的接種：將圓濾紙片放置在平板培育基上，用吸管汲取少許枯草芽孢桿菌菌懸液滴到濾紙片上(4) 培育：28 培育箱中培育4天(5) 察看結(jié)果 實驗二 酶聯(lián)免疫法測ABA含量儀器： 酶聯(lián)免疫儀 酶標板 752分光光度計實驗原理 本方法是一種固相抗原型酶聯(lián)免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先將ABA蛋白質(zhì)復合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結(jié)合,然后將待測的

3、ABA(樣品或規(guī)范品)和兔抗ABA抗體參與微量滴定板的孔中,進展競爭反響,接著棄去上清液,洗滌固相外表,參與酶標二抗使其與結(jié)合在固相ABA上的抗體反響,最后去除多余的未反響的酶標二抗,測定與固相結(jié)合的酶活性,酶活性和待測ABA含量呈負函數(shù)關(guān)系,即固相ABA結(jié)合的抗體與酶標二抗量(OD或B%)隨待測ABA含量添加而減少,以一系列知濃度的ABA的OD值制圖而獲得規(guī)范競爭性抑制曲線,對于未知樣品B,只需在同樣條件下測定反響后的OD值,就可以從規(guī)范曲線上查到ABA的量。測定方法包被：在微量滴定板內(nèi)準確參與100LABA包被液，37濕盒過夜。標樣稀釋?：取8支試管每管加150LDB，第一管中參與50L2

4、000ng50L規(guī)范液，充分渦旋后，取50L至第二號管中，同樣渦旋后，取50L到第三管；依次稀釋到第六管，稀釋后的規(guī)范ABA依次為1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng50L。洗板：從37濕盒中取出滴定板，恢復到室溫后，棄去包被液，用WB洗滌緩沖液洗滌三次，甩干吸水紙。加樣：18孔對應(yīng)參與ABA標樣50L，10號孔相應(yīng)參與最濃ABA標樣，9號孔加50LDB，三排反復；然后每孔加50L抗體，37 45分鐘。洗板：加酶標二抗：每孔加100L，37反響1小時。洗板：顯色：各孔加10LOPD顯色液，37 20分鐘。終止反響：各

5、孔加50L 6NH2SO4。讀數(shù)：490nm讀取OD值。其中10號孔調(diào)零,而9號孔為最大值(B0),18號孔的OD值為B。結(jié)果計算：以InB/B01B/B0為縱坐標，以規(guī)范ABA濃度的常用對數(shù)lgABA為橫坐標,繪制曲線。實驗三 質(zhì)粒DNA的提取及其酶切實驗?zāi)康?經(jīng)過本實驗學習和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 。實驗原理 堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差別來分別它們。 在pH值介于12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋構(gòu)造解開而被變性，雖然在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互纏繞，仍會嚴密地結(jié)合在一同。當參

6、與pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH 至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍堅持在一同，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那木迅速而準確，它們纏繞構(gòu)成網(wǎng)狀構(gòu)造，經(jīng)過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)SDS復合物等一同沉淀下來而被除去。實驗步驟提取質(zhì)粒將2 ml 含相應(yīng)抗生素的LB液體培育基參與試管中，接入上述的含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，37振蕩培育過夜。取培育物倒入微量1.5ml離心管中，4000 r/min 離心 2 min。棄上清，吸盡殘液，使細胞沉淀盡能夠枯燥。參與100ul溶液，充分混勻，室溫放置10 min

7、。 加200 ul溶液 新穎配制，蓋緊管蓋，悄然顛倒數(shù)次混勻，將離心管放冰上 5 min 。參與150 ul 溶液 冰上預冷，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置 15 min 。12000 r/min ,離心15 min ，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。參與等體積酚：氯仿1：1去蛋白，反復混勻，12000 r/min，離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。參與2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置510 min。12000r/min離心 5 min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。用1 ml 70% 乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中枯燥。加50 ul T

8、E緩沖液，其中含有20 ug/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，20保管。二酶切取DNA溶液，加酶切緩沖液，EcoRI酶1 ul，無菌水補至總體積10 ul，37保溫3h,加終止液，預備下個實驗電泳，分析質(zhì)粒DNA的限制性酶切圖譜。實驗四 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實驗?zāi)康慕?jīng)過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。實驗原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷在電場中向正極挪動。由于糖磷酸骨架在構(gòu)造上的反復性質(zhì)，一樣數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以一樣的速度向正極方向挪動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取

9、決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進展分別。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系.。凝膠電泳不僅可以分別不同相對分子質(zhì)量的DNA, 也可以分別相對分子質(zhì)量一樣,但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實驗提取的pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA，簡稱 CCCDNA)，開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂，open circular DNA, 簡稱OCDNA,線狀質(zhì)粒DNA ，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂，linear

10、DNA，簡稱L DNA。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，開環(huán)質(zhì)粒DNA。 實驗步驟制備瓊脂糖凝膠電泳槽及用膠量將瓊脂糖按比例溶入1X TAE緩沖液中，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60, 參與適量EB, 混勻。 二膠板的制備取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好一定封嚴，不能留縫隙。將有機玻璃內(nèi)槽放置于一程度位置，并放好樣品梳子。梳子調(diào)整齊將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，漸漸倒入有機玻璃內(nèi)槽，直至有機玻璃板上構(gòu)成一層均勻的膠面留意不要構(gòu)成氣泡。待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，將膠槽放在電

11、泳槽內(nèi)。參與電泳緩沖液至電泳槽中。 三加樣, 用移液器將已參與上樣緩沖液的DNA樣品參與樣品孔記錄點樣順序及點樣量。 四電泳接通電泳槽與電泳儀的電源留意正負極，DNA片段從負極向正極挪動。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超越5 V/cm。 當溴酚藍染料挪動到距凝膠前沿12cm處，停頓電泳。 五染色將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中，染色以察看在瓊脂糖凝膠中的帶戴手套操作。實驗五 真核生物高分子量DNA制備實驗原理 利用液氮對植物組織進展研磨，從而破碎細胞。細胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細胞膜，使蛋白量變性而沉淀下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，

12、得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。實驗資料: 新穎植物葉片實驗步驟取4g新穎葉片，在液氮中研磨成粉末狀越細越好。轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，參與16ml TENbf，充分混勻。65水浴保溫20min。從水浴中取出離心管，參與5ml 5 mol/L KCl溶液，混勻，水浴20min。4000r/min 離心 20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到另一50ml離心管中。加等體積酚氯仿混勻，12000rmin 離心5min，取上清。加等體積氯仿，混勻，12000rmin 離心5min，取上清。參與0.61倍體積的異丙醇沉淀DNA，混勻。放置時間離心獲得沉淀，70乙醇洗3次。風干沉淀。參與500LTE緩沖液，溶解DNA。

13、取3L上清液,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度、質(zhì)量。 實驗六 PCR基因擴增實驗?zāi)康模赫莆誔CR反響的根本原理與實驗技術(shù)實驗原理：PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反響，可以選擇性擴增一段DNA序列。其根本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物可以與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈，反響完成后，將反響混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開場第二輪的合成反響。這種延伸變性退火延伸的循環(huán)可以反復多次，使所需求的DNA片段得到特異性的擴增。變性：加熱使模板DNA

14、在高溫下94變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而構(gòu)成兩條單鏈.退火：使溶液溫度降至5060，模板DNA與引物按堿基配對原那么互補結(jié)合.延伸：溶液反響溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反響混合物中的4種脫氧核苷三磷酸dNTPs，按53方向復制出互補DNA.上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從實際上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該添加一倍，新構(gòu)成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2530個循環(huán)后DNA可擴增106109倍。典型的PCR反響體系由如下組分組成：DNA模板、反響緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶

15、。儀器、實驗用品、試劑一、儀器PCR儀冰箱電泳儀微波爐電泳槽離心機紫外檢測儀二、試劑PCR BufferTAE(500ml)Ice瓊脂糖Tag溴化乙錠d NTPs溴酚藍模板DNAmarkerPrimer1Primer2石蠟油三、其它用品移液器 一套Tip一套 PCR管 (0.2ml)防護眼鏡一次性手套膠帶四: 實驗步驟時間安排： 上午 10：30 配反響體系中午 PCR下午 電泳PCR范提供反響體系10 x Bf 1x 2.5ulTag 5u/ul 0.2ulD NTPs 2.5um 2.0ulPrimer1 10um 2.5ul Primer2 10um 2.5ul DNA 2.0ul-H2

16、O to 25ul混勻，加石蠟油程序：94 預變性 3 以下35cycle 94 變性 1.5min 50/55 退火 30s 72 延伸 1-2min 最后 72 5min電泳 配制1瓊脂糖凝膠，取10ul擴增產(chǎn)物電泳分析PCR結(jié)果bf : KCl 50mmol/L 促進引物退火Tris.HCl 10-50mmol/L PH 8.4BSA 100ug/ml 乙?；腂SA 對酶有維護作用Mg離子: 1.5-2mmol/L 與d NTP 結(jié)合PO4離子與引物中的 EDTA結(jié)合 與模板中的 EDTA結(jié)合4. Taq 活性需求游離的Mg離子購 d NTP 為25um, 需稀釋10倍至2.5umPr

17、imers: Boo12 F 10D Boo14 R 10D分子量 24bp * 324.5 = 7788質(zhì)量數(shù) 10D 33 33ug摩爾數(shù) 33 7788 4.2 n mol濃度 4.2 n mol/84ul H2O = 50um 取母液50um 1ul加水至5ul , 稀釋5倍，那么終濃度為10um幾種常用反響體系：在0.2ml Eppendorf 管內(nèi)配制25ul反響體系 (華美PCR kit)安排 4人一組 每班可分5組 終濃度10 x bf 5 ul (MgCl2-free)MgCl2 3 25mmol/L 1.54dNTPs 4 2.5mmol/L/each 0.2P1 2 12

18、.5pmol/ul 0.25P2 2 12.5pmol/ul 0.25 DNA 2 1ng/ul 2 ngTaq 1 3u/ul H2O 31 Total 50ul混勻離心 50ul 石蠟油 離心PCR 程序 94 5min94 1min 60 1min72 1min30 cycle72 5min瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果 配制1瓊脂糖凝膠，取10ul擴增產(chǎn)物電泳。 實驗七 DNA重組技術(shù)酶切、銜接實驗原理: DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開，經(jīng)分別純化后，用鏈接酶將其銜接，構(gòu)成新的DNA分子。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特

19、異位點上,并切割雙鏈DNA。如EcoR切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合運用多種限制性內(nèi)切酶，經(jīng)過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的運用價值依賴于它的準確性和準確程度。 限制性內(nèi)切酶的一個活性單位U實際上， 1hr,切1ug DNA 樣品中一切專注位點的所用酶量實踐反響，1U酶：能完全切割1ul DNA的一個位點不能完全 切割1ug 帶有4個酶切位點的樣品和不純的樣品假設(shè)采用兩種限制性內(nèi)

20、切酶,必需求留意分別提供各自的最適鹽濃度。假設(shè)兩者可用同一緩沖液,那么可同時水解。假設(shè)需求不同的鹽濃度,那么低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必需首先運用,隨后調(diào)理鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。限制性內(nèi)切酶的運用本卷須知： 10 x bf o 無鹽留意混勻 L 低鹽H 高鹽儀器水浴鍋(37，65) 凝膠電泳滅菌鍋 紫外檢測離心機試劑及溶液 DNA EcoR IpUC18 無菌水 終止液 (40%蔗糖) 70，100酒精3Mol/L KAc(pH5.2) ice瓊脂糖 溴酚藍TE TAEEB marker用品移液器 20ul 一次性手套tip 20ul 防護鏡 離心管 0.5ml 吸水紙膠帶 浮子

21、PUC 18/19, DNA2人組，一人做 PUC18 酶切 20ug Takara 25ug/個 一人作DNA 酶切 15ugEcoR1 1ul/人 10 u (20ul) Takara 4000u/個四：酶切反響: DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內(nèi)切酶儲存液中時,會影響其進一步運用,因此在汲取限制性內(nèi)切酶時,每次都要用新的吸管頭.留意 1.酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否那么DNA溶液中其他成分會干擾酶反響。 2、酶活力通常用酶單位U表示，酶單位的定義是：在最適反響條件

22、下，1小時完全降解1mg DNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象DNA那樣易于降解，需適當添加酶的運用量。反響液中參與過量的酶是不適宜的，除思索本錢外，酶液中的微量雜質(zhì)能夠干擾隨后的反響。 3、市場銷售的酶普通濃度很大，為節(jié)約起見，運用時可事先用酶反響緩沖液1進展稀釋。另外，酶通常保管在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反響液中甘油濃度控制在1/10之下，否那么，酶活性將受影響。反響 1. PUC 4ul (0.5ug/ul) buffer 2ul EcoR1 1ul 350u/ul(15u/ul) H2O 15ul - Total 20ul 反響 2. DNA 4ul (1.5ug,

23、 0.4ug/ul) bf 1 EcoR1 1 H2O 4 - Total 10ul37,2hr終止反響 65 10min各取2ul酶解液，電泳EcoRI切割DNA后電泳得到6個片段,長度分別為 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb實驗八 DNA重組技術(shù)二銜接實驗原理：質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。假設(shè)要克隆較小的DNA片段(10kb且構(gòu)造簡單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進展克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相銜接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌,即可完成。但在實踐任務(wù)中, 如何區(qū)分插入有外源

24、DNA的重組質(zhì)粒和無插入而本身環(huán)化的載體分子是較為困難的。經(jīng)過調(diào)整銜接反響中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的本身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆戰(zhàn)略,如載體去磷酸化等來最大限制的降低載體的本身環(huán)化,還可以利用遺傳學手段如互補景象等來鑒別重組子和非重組子。外源DNA片段和質(zhì)粒載體的銜接反響戰(zhàn)略有以下幾種：1、帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進展消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段。2、帶有一樣的粘性末端 用一樣的酶或同尾酶處置可得到這樣的末端。3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚

25、合酶補平所致。由于平端的銜接效率比粘性末端要低得多，故在其銜接反響中，T4 DNA銜接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需參與低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,那么可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上適宜的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的運用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分填平3凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進展銜接。一、 資料 PUC，DNA二、 設(shè)備 恒溫搖床， 臺式

26、高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳安裝， 電熱恒溫培育箱 ， 電泳儀無菌，超凈任務(wù)臺， 微量移液槍，Tip. eppendorf管。 三、 試劑 10X bf T4 鏈接酶 瓊脂糖 TAE Marker EB 溴酚蘭四、 銜接反響 PUC (酶切) 5ul DNA (酶切) 5ul T4 ligase 1ul (350u/ul) 10 x bf 1.2H2O -Total 12ul 14,O/N. DNA ligase 對溫度敏感，15以上失活。 五、電泳實驗九 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗原理 將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化(T

27、ransformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研討領(lǐng)域的根本實驗技術(shù)。 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞普通是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R,M),它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實驗中要思索以下幾個重要要素： 1. 細胞生長形狀和密度: 細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可經(jīng)過監(jiān)測培育液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較適宜。密度過高或缺乏均會影響轉(zhuǎn)化

28、效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細胞到達飽和。普通情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超越感受態(tài)細胞體積的5。 3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保管于枯燥的冷暗處。 4. 防止雜菌和雜DNA的污染。 本實驗以E.coli DH5a菌株為受體細胞,并用CaCl2處置,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可經(jīng)過Amp抗性來挑選轉(zhuǎn)化子。如受體細胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，那么在含Amp的培育基上不能生長。能在Amp培育基上生長的受體細胞

29、轉(zhuǎn)化子一定已導入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進展電泳、酶切等進一步鑒定。儀器 控溫搖床(37) 高速冷凍離心機水浴鍋 冰箱-20,70超凈任務(wù)臺 培育箱(37) 752分光光度計 滅菌鍋試劑 CaCl2 無菌水,冰胰蛋白胨 酵母粉 Amp NaCl其他用品移液器， 槍頭1.5ml ,50ml 離心管 三角瓶 500ml 200ml 6cm平皿 試劑瓶60ml量筒 燒杯瓊脂 甘油酒精燈 三角玻棒酒精棉球 火柴溶液配制 0.1 mol/L CaCl2溶液 配置 滅菌LB液體培育基氨芐青霉素Amp，用無菌水配制成50_60 mg/mL溶液，抽慮滅菌置20冰箱中保管。資料 E.col

30、i.DH5 質(zhì)粒 DNA 五: 實驗步驟：(CaCl2) 20人一班，分三組第一天：從大腸桿菌DH5平板上挑取一個單菌落接于2 mL LB液體培育基的試管中,37振蕩培過夜。 第二天：取0.5 mL菌液轉(zhuǎn)接到一個含有50 mL LB液體培育基錐形瓶中，37振蕩培育23 h(此時，OD600 0.4-0.5，細胞數(shù)務(wù)必 108mL。此為實驗勝利的關(guān)鍵)3. 將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，冰上放置10 min。4. 離心10 min4000r/min,回收細胞。45. 倒出培育液，將管倒置1min以便培育液流盡。6. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 10 mL懸浮沉淀，立刻放在冰上30 min。7. 04 6000 r/min,離心10 min，回收細胞。8. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2 mL懸浮細胞，務(wù)必放在冰上。9. 分裝細胞，每200 L一份。此細胞為感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化：10. 取200 L新穎制備的感受態(tài)細胞，參與DNA 2 L50 ng 混勻冰上放置30 min。同時作兩個對看管受體菌對照：200 L感受態(tài)細胞2 L無菌水質(zhì)粒對照：200 L 0.1 mol/L CaCl2溶液2 L 質(zhì)粒DNA溶液11 .將管放到42循環(huán)水浴12 min。12. 冰浴2 mi