利用寡核苷酸芯片診斷地中海貧血的無創(chuàng)方法的探討

1、PAGE PAGE 6利用寡核苷酸芯片診斷地中海貧血的無創(chuàng)方法的探討高天作者簡(jiǎn)介：高 天，女，黑龍江齊齊哈爾人，博士研究生，醫(yī)師，主要從事產(chǎn)前診斷方面的研究。電話信作者：梁志清，電話（023）68754409，E-mail: HYPERLINK mailto:zhi.lzliang zhi.lzliang 梁志清1聶艷麗2 張亮2 朱虹琳2 吳偉靜2 胡華1（1第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400038；2 生物芯片北京國家工程研究中心，北京 102206）摘要： 目的 通過比較地中海貧血臍血與正常臍血和外周血的全基因組表達(dá)差異，進(jìn)一步探討早期診斷地中海貧血的無創(chuàng)

2、方法。方法 利用含有人約22000條Oligo DNA的人類全基因長(zhǎng)寡核苷酸芯片，對(duì)1例地中海貧血患兒臍血與1例正常臍血及1例外周血分別配對(duì)檢測(cè)差異基因表達(dá)，并用Real-timePCR驗(yàn)證差異基因HBA2在臍血和外周血中的差異性。采用SAM等顯著性檢驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上差異表達(dá)的基因。結(jié)果 兩組芯片結(jié)果顯示，檢測(cè)到的基因共4205條，其中兩者差異的基因共822條(ratio2 or0.5)；通過間接比較兩組差異率為19.5%，即重復(fù)率為81.5%。Real-time PCR的Ct值結(jié)果亦顯示HBA2在臍血和外周血中表達(dá)無差異。結(jié)論 高通量的基因芯片技術(shù)能夠篩選出大量的地中海貧血差異表達(dá)基因

3、，直接與地中海貧血相關(guān)的HBA2蛋白在臍血和外周血中的表達(dá)無差異。預(yù)示著利用微陣列分析法對(duì)地中海貧血進(jìn)行早期診斷時(shí)，可以采用無創(chuàng)技術(shù)制備芯片樣本。關(guān)鍵詞: 地中海貧血; HBA2; 基因表達(dá); 臍血; 外周血; 寡核苷酸芯片Study of prenatal diagnosis in thalassemia by the method of Non-invasive based on Oligonucleotide MicroarrayGAO Tian1, LIANG Zhi-qing1, NIE Yan-li2, ZHANG Liang2, ZHU Hong-lin2 WU Wei-jing

4、2 HU Hua1 (1 Department of Pathology, Southwest Hosp ital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, 2 National Engineering Research Center for Beijing Biochip Technology, Beijing 102206, China)Abstract: Objective To analyze differentially expressed genes between thalassemia and normal on

5、e and peripheral blood to study the method of minimally invasive for prenatal diagnosis. Methods Gene-expression profiles of 1 sample of -thalassemia and 1 sample of normal cord blood and peripheral blood were analyzed by unsupervised Hierarchical clustering in order to get the specifically differen

6、tially expressed genes. The gene expression presence of HBA2 were verified by Real-time PCR. Results A total of 4205 genes of thalassemia were checked. Of them, 822 genes were the differential genes in both groups (ratio2.0or0.05). The differential rate of them was 19.5%, in an other word their recu

7、rrence rate was 81.5%. There were no significant differences between cord blood and peripheral blood by the value of Ct in HBA2. Conclusions These data are helpful for a better understanding of thalassemia and contribute to the development of diagnostic and therapeutic strategies.There were no signi

8、ficant differences between cord blood and peripheral blood in the expressions of thalassemia by the gene of HBA2. Its prognosticated we can use the method of Non-invasive for prenatal diagnosis in thalassemia by the method of microarry.Key words: thalassemia;Gene; cord blood; peripheral blood ; olig

9、o microarry地中海貧血是一組遺傳性慢性溶血性疾病。傳統(tǒng)診斷地中海貧血的方法一般是采用患兒臍帶血或者孕婦羊水。常規(guī)的基因和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)已不能滿足臨床的需要，因?yàn)閷?duì)于反復(fù)妊娠發(fā)病的或者輕型的地中海貧血患者而言，傳統(tǒng)的分子診斷方法不能檢測(cè)到基因突變或片段缺失。目前，在應(yīng)用于這種高度異質(zhì)性遺傳病的各種分子診斷方法中，快速簡(jiǎn)便的基因芯片技術(shù)引人注目。以分子雜交為基礎(chǔ)的芯片技術(shù)是基于雜交的寡核苷酸微陣列1，是一種在基因組中尋找新位點(diǎn)的方法。目前為止通過微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)遺傳病地中海貧血尚未見有報(bào)道。本研究擬通過微陣列分析法尋找基因組中新的位點(diǎn)，同時(shí)比較臍血和外周血的差異。以期指導(dǎo)臨床上采

10、用無創(chuàng)技術(shù)對(duì)地中海貧血進(jìn)行早期診斷。1材料與方法1.1 標(biāo)本來源選擇第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院已明確診斷的地中海貧血患兒的臍帶血。對(duì)照正常血樣取自正常產(chǎn)前體檢胎兒臍帶血和外周血?；颊邿o任何基礎(chǔ)疾病及免疫抑制劑治療史，取材均征得患者和院方同意。所取樣本未經(jīng)任何藥物處理，立即提取總RNA。采用Trizol(北京百泰克生物公司)提取樣本中總RNA；進(jìn)一步采用NucleoSpin RNA clean-up試劑盒（MACHEREY-NAGEL, Germany）對(duì)總RNA進(jìn)行過柱純化；用雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描( LuxScanTM, 北京博奧生物芯片公司)；得到的掃描圖片用SpotData 基因芯片數(shù)據(jù)

11、分析軟件( 北京博奧生物芯片公司) 把圖片信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。RNA提取所用試劑Trizol購自Invitrogen公司；氯仿、異丙醇和無水乙醇購自北京化學(xué)試劑公司；DEPC購自Sigma公司；SSII和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；DNA酶I、r-Taq DNA聚合酶和dNTPs購自TaKaRa公司；Oligo dT15購自Promega公司；RNA純化試劑盒購自MN公司；實(shí)時(shí)定量PCR引物均由Invitrogen公司合成。1.2 總RNA提取采用Trizol提取樣本中總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，進(jìn)一步采用NucleoSpin RNA clean-up試劑盒對(duì)總R

12、NA進(jìn)行過柱純化，測(cè)定濃度和OD260/280，并電泳檢測(cè)其完整性。分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量時(shí)，OD260/280在1.82.0，0.8%瓊脂糖甲醛變性膠電泳，28S和18SRNA亮度比值在2.0左右。1.3 樣本RNA熒光標(biāo)記取5g總RNA，作為模板反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA，進(jìn)一步體外擴(kuò)增合成cRNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄并摻入dCTP-Cy3和dCTP-Cy5(GE healthcare)進(jìn)行標(biāo)記。采用熒光交換的方法: 即在一張芯片上, 地中海貧血臍血樣本標(biāo)記cy5熒光素, 正常臍血樣本標(biāo)記cy3熒光素; 在第二張熒光交換的芯片上,正常臍血樣本標(biāo)記cy5熒光素, 而地中海貧血樣本標(biāo)記cy3熒光素。我

13、們認(rèn)為只有在兩張芯片上變化趨勢(shì)都一致的基因才是真正生物學(xué)意義上變化的基因。1.4 雜交、清洗及掃描 標(biāo)記好的探針與雜交緩沖液充分混合，配制成80l的雜交液（終濃度：3SSC，0.2%SDS，5Denharts，25%甲酰胺），95變性3分鐘，冰浴3分鐘。42雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42左右含0.2%SDS，2SSC的溶液中洗4min，然后在0.2SSC中洗4min。離心干燥，用晶芯LuxScan10K微陣列芯片掃描儀雙通道掃描儀掃描獲得芯片雜交圖2。1.5 生物信息分析芯片雜交結(jié)束后經(jīng)過清洗, 用雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描, 得到的掃描圖片用SpotData基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件( 北京博奧生物

14、芯片公司) 把圖像數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)文件。用LOWESS方法對(duì)雙通道芯片的信號(hào)比值進(jìn)行歸一化3。在本研究中以地中海貧血臍血樣本/正常臍血樣本（外周血樣本）比值2和0.5分別作為顯著性上調(diào)或顯著性下調(diào)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，找出配對(duì)樣本的差異表達(dá)基因，對(duì)地中海貧血臍血樣本和兩類正常對(duì)照的差異表達(dá)基因取交集。對(duì)差異基因進(jìn)行CLUSTER分析。1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HBA2在地中海貧血中的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）采用 HYPERLINK /zh-hans/products/_supergreen_pcr_ii514 o 晶芯 SuperGreen熒光定量PCR通用試劑盒II 晶芯

15、 SuperGreen熒光定量PCR通用試劑盒（北京博奧生物芯片公司），實(shí)驗(yàn)方法按試劑說明。HBA2引物采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)：上游引物5GTTCTTTGAGTCCTTTGGGG3，下游引物5ATTTGTGGGGTG- AATTCCTT3，-ACTIN引物：上游引物5CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3，下游引物上游引物5GCTGTCACCTTCACCGTTCC3。反應(yīng)條件：655min，冰浴5min，5030 min合成cDNA；PCR反應(yīng)953min，9530s，601min，40個(gè)循環(huán)，7245s。結(jié)果分析方法：CP(Crossing Point)表示反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度顯著大

16、于背景值時(shí)的循環(huán)數(shù)，也稱作Ct(threshold cycle)值。比較兩個(gè)樣本中檢測(cè)基因的表達(dá)情況的差異，通過下面公式進(jìn)行計(jì)算(見公式1)。圖中E為實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率；ref是校準(zhǔn)基因，一般用表達(dá)豐度在不同樣本中都相對(duì)穩(wěn)定的看家基因；target表示靶基因；CP(controlsample)是對(duì)照樣本的CP值減去檢測(cè)樣本的CP值得到的差值。公式1 2 結(jié)果2.1 地中海貧血表達(dá)譜變化通過分層聚類分析（Hierarchical）并使用TREEVIEW軟件查看4，檢測(cè)到的基因共4205條，其中兩者差異的基因共822條，分別位于A與D部分，相同表達(dá)趨勢(shì)的基因分別位于B與C部分(見圖1)；經(jīng)間

17、接比較結(jié)果顯示差異率為19.5%。通過SAM統(tǒng)計(jì)分析T-test來挑選差異表達(dá)基因(見圖2)。圖 1 分層聚類分析結(jié)果1：地中海貧血與臍血，2：地中海貧血與外周血，A：臍血與外周血差異基因部分，且相對(duì)于外周血下調(diào)的基因；B：兩組共同上調(diào)基因部分；C：兩組共同下調(diào)基因部分；D：臍血與外周血差異基因部分，且相對(duì)于外周血上調(diào)的基因圖 2 T-test 火山圖紅點(diǎn)：上調(diào)基因，綠點(diǎn)：下調(diào)基因2.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析 HBA2基因?qū)崟r(shí)定量PCR(Real-time PCR)驗(yàn)證結(jié)果顯示，與正常臍血和外周血比，該基因在地中海貧血中呈低表達(dá)，且有顯著性差異 (ratio=0.44，ratio0.50) (見

18、圖3-6，表1); 同時(shí)結(jié)果顯示，HBA2在臍血和外周血中表達(dá)無差異 (ratio=1.34, 0.5ratio2.0) (見圖3-6，表2)。圖 3 HBA2擴(kuò)增曲線A為-ACTIN曲線，B為HBA2曲線，1、2、3、4、5、6分別為地中海貧血、臍血、外周血中-ACTIN和HBA2的擴(kuò)增曲線。圖 4 HBA2溶解曲線A為-ACTIN曲線，B為HBA2曲線，1、2、3、4、5、6分別為地中海貧血、臍血、外周血中-ACTIN和HBA2基因的溶解曲線。圖5 HBA2的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證 HBA2-1、HBA2-2、HBA2-3分別為地中海貧血、臍血、外周血中HBA2表達(dá)情況，縱坐標(biāo)為歸一化前rat

19、io值圖 6 HBA2與-ACTIN實(shí)時(shí)定量PCR鑒定M：Marker，DL2000；1-3為HBA2；4-6為-ACTIN；1、4為地中海貧血；2、5為臍血；3、6為外周血表 1 HBA2基因地貧與正常血樣Real-time PCR結(jié)果樣本/內(nèi)參Ct值Ct歸一化前ratio比率（ratio）actin-地貧20.75actin-臍血20.44-0.310.81actin-外周血20.29-0.460.73HBA2-地貧21.27HBA2-臍血19.76-1.510.350.43HBA2-外周血20.04-1.230.430.59表 2 HBA2基因臍血與外周血Real-time PCR結(jié)果樣

20、品/內(nèi)參Ct值Ct歸一化前ratio比率（ratio）ACTIN-臍血20.44ACTIN-外周血20.29-0.150.9HBA2-臍血19.76HBA2-外周血20.040.281.211.353 討論地中海貧血的基因診斷和產(chǎn)前診斷先后經(jīng)歷了DNA 點(diǎn)雜交；限制性內(nèi)切酶酶譜分析；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)連鎖分析；寡核苷酸(ASO)探針雜交；PCR體外基因擴(kuò)增等階段，特別是PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，使地中海貧血基因診斷檢測(cè)技術(shù)日趨成熟。但是，迄今大部分患者并未直接受益于此，原因是多方面的，費(fèi)用昂貴是個(gè)重要因素。此外，操作較繁雜、費(fèi)時(shí)，對(duì)操作者技術(shù)水平要求較高等也限制了這些方法的普

21、及，因此費(fèi)用低廉、結(jié)果可靠、使用方便、安全省時(shí)的基因診斷技術(shù)的開發(fā)仍然是人們翹首以待的事情。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)值得注意的現(xiàn)象：即地中海貧血與正常臍血及地中海貧血與正常外周血兩組芯片數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，檢測(cè)到的基因共4205條，其中兩者共同的差異基因822條(ratio1.50or0.67)，通過間接比較兩組差異率為19.5%，即重復(fù)率為81.5%，提示利用表達(dá)譜芯片篩查地中海貧血中差異基因時(shí)，與該疾病相關(guān)的基因在臍血和外周血中表達(dá)無差異。地中海貧血是一組遺傳性疾病，它是由血紅蛋白的珠蛋白肽鏈的合成抑制、失衡，引起無效造血和溶血性貧血。傳統(tǒng)診斷地中海貧血的方法一般是采用患兒臍帶血或者孕婦羊水，無法

22、避免對(duì)胎兒的有創(chuàng)風(fēng)險(xiǎn)。并且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是利用反向點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行明確診斷，此方法操作較繁雜、費(fèi)時(shí)且只能檢測(cè)出常見的幾種型地中海貧血5。因此，迫切需要開拓新的方法或策略為地中海貧血尋求和發(fā)現(xiàn)新的更簡(jiǎn)便、更精確、易于推廣的診斷方法。表達(dá)譜基因芯片是用于基因功能研究的一種基因芯片，可以對(duì)基因表達(dá)的個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合的分析和判斷，迅速將某個(gè)或幾個(gè)基因與疾病聯(lián)系起來，極大地加快這些基因功能的確立，同時(shí)進(jìn)一步研究基因與基因間相互作用的關(guān)系。是基因功能研究的一種重要手段。芯片結(jié)果顯示，與正常臍血和外周血比較珠蛋白2 (HBA2)在地中海貧血

23、中表達(dá)顯著下調(diào)(ratio=0.44，ratio0.50)。因此，本實(shí)驗(yàn)以HBA2為代表基因進(jìn)一步通過Real-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。結(jié)果表明，HBA2在臍血和外周血中表達(dá)無差異(ratio=1.34, 0.5ratio2.0)，提示利用微陣列分析法對(duì)地中海貧血進(jìn)行早期診斷時(shí)，可以采用無創(chuàng)方法取材制備芯片樣本。近年來，利用基因芯片對(duì)疾病的血液樣本制備得到大家廣泛關(guān)注6。我們?cè)诘刂泻Ｘ氀磉_(dá)譜的篩選中發(fā)現(xiàn)大量的基因以及它們的細(xì)胞功能可能與地中海貧血相關(guān)，這些基因有可能成為地中海貧血潛在的代表基因而值得進(jìn)一步關(guān)注和深入研究，以期達(dá)到可以指導(dǎo)臨床上對(duì)地中海貧血的早期診斷。參考文獻(xiàn)：1 Pfi

24、ster S, Schlaeger C,Mendrzyk F, et al. Array-based profiling of reference- independent methylation status (aPRIMES) identifies frequent promoter methylation and consecutive downregulation of ZIC2 in pediatric medul-loblastoma. Nucleic Acids Res, 2007, 35(7): e51. 2 Tang, Y et al. Up-regulation of the expression of costimulatory molecule CD40 in hepatocytes by hepatitis B virus X antigen. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 38