脆性X綜合征的產(chǎn)前基因篩查與診斷

1、脆性X綜合征的產(chǎn)前基因篩查與診斷楊丹彤賈頤舫吳愛華張愛東【摘要】目的 對脆性X綜合征進行產(chǎn)前基因篩查與診斷。方式采納聚合酶鏈?zhǔn)椒从?PCR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對32例妊婦 及其胎兒的脆性X基因(CGG)n重復(fù)序列進行檢測，同時采納PCFT增 牙幼基因?qū)μ盒詣e進行鑒定。結(jié)果 在32例妊婦及其胎兒中，檢出1例妊婦為前突變攜帶者，1例男性胎兒為脆性X綜合征患者。結(jié)論 采 納PCFT增脆性X基因(CGG)n重復(fù)序列，結(jié)合擴增牙幼基因進行性別 鑒定，可對脆性X綜合征進行產(chǎn)前篩查與診斷?！娟P(guān)鍵詞】脆性X綜合征；聚合酶鏈反映；牙幼基因；產(chǎn)前診斷Prenatal screening and diag

2、nosis for fragile X syndromeYANG Dantong, JIA Yifang, WU Aihua, et al. Shandong Provincial Key Laboratory for Improving Birth Outcome Technique Shandong Provincial Family Planning Science and Technology Institute, Jinan, Shandong 250002, ChinaAbstract Objective To screen and diagnose fragile X syndr

3、ome prenatally by PCR. Methods The CGG repeat region inthe FMR 1 gene was amplified by PCR and was detected by PAGE in 32 pregnant women and their fetuses and the fetal sex wasidentified by the amplification of amelogenin gene. Results One premutation carrier and one male fetus with fragile X syndro

4、me were detected from 32 pregnant women and their fetuses. Conclusion Amplification of the CGG repeat region in the FMR1 gene and the amelogenin gene by PCR can be applied for prenatal screening and diagnosis for fragile X syndrome.【Key words Fragile X syndrome; Amelogenin gene; Prenatal screening;

5、Prenatal diagnosis脆性X綜合征(fragile X syndrome , FXS)一種X連鎖遺 傳病，是危害兒童智力發(fā)育致使兒童智力低下的要緊遺傳病之一，該 病的臨床診斷與產(chǎn)前診斷一直備受關(guān)注。1991年Verkerk等1發(fā)覺 了 FXS相關(guān)致病基因FMR 1,提出FMR 1基因內(nèi)(CGG)n重復(fù)序列 的不穩(wěn)固性擴展及其上游CpG島的異樣甲基化是致使該病的分子基礎(chǔ)。爾后，檢測FMR 1基因(CGG)n重復(fù)序列及甲基化狀況的分子生 物學(xué)方式開始用于FXS的診斷與產(chǎn)前診斷。本研究成立了穩(wěn)固的聚合 酶鏈反映(polymerase chain reaction,PCR)擴增 FMR

6、1 基因的(CGG)n重復(fù)序列作為FXS的篩查與診斷方式，結(jié)合PCFT增牙幼基因(amelogenin)作為性別的診斷方式，用于 FXS的產(chǎn)前篩查與診斷，報 告如下。對象與方式一、對象2007年1月2007年10月來本所優(yōu)生遺傳門診進行羊水染 色體檢查的無FXS家族史妊婦30例，還有2例妊婦系FXS家系成員， 其中1例已生有1個FXS男性患兒。32例妊婦均為單胎懷胎。妊婦于 孕1822周抽取羊水，留用5 ml , 3 000 r/min 離心10 min后棄上 清，細胞沉淀-20 C保留備用。同時取妊婦外周血5 ml,0.1mol/L EDTA 抗凝，-20 C保留備用。二、方式1.基因組DN

7、AI?。翰杉{基因組 DNAI取試劑盒(Takara公 司)，按說明提取。1基因(CGG)n重復(fù)序列：參照文獻2,在FMR 1基因5非翻譯區(qū)(CGG)n重復(fù)序列雙側(cè)設(shè)計合成一對引物(由上海生工生物技術(shù) 合成)，序列如下。FMRF 5GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCC! GGTFMRR 5AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCC TCCAPCR反映整體積為 25 ”，含 1 x PCR buffer , 2U Golden TaqDNA!合酶（ABI 公司），12.5 %二甲亞碉（DMSO） 12.5 pmol/L 引 物，10 mmol/L dNTP, 50 ng

8、/L基因組DNA反映條件為：98 C預(yù)變 性 10 min, 97 C變性 60 s, 61 C退火 60 s,72 C延伸 120 s,共 35個循環(huán)，最后72 C延伸5min。.PCR擴增牙幼基因：選擇X Y同源牙幼基因（amelogenin） 第一個內(nèi)含子周圍的特異序列進行擴增，引物序列如下。Amel F 5 CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGAmel R 5ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG反映體系為 25 6 ,含 1XPCRbuffer , 1.5 UTaq 酶，12.5 pmol/L 弓I物，10 mmol/L dNTP 50 ng/L 基因組 DNA

9、 擴增條件：95 C 預(yù)變性3 min , 94 C變性60 s , 60 C退火30 s , 72 C延伸60 s , 共35個循環(huán)，最后72 C延伸5 min。.PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測：取 PCR產(chǎn)物 10屋加入2 ”載樣緩沖液(0.05 喊酚藍-30 %T油)，加樣于6 % 非變性聚丙烯酰胺凝膠中，300 V電泳2 ho電泳完畢掏出凝膠前后于 10 %醇-0.5 充酸溶液中固定10 min, 0.2 %AgNO3液染色10 min, 及1.5 %NaOH -0.5 %甲醛溶液顯色10 min,最后以10 %乙酸溶液終 止反映。結(jié)果30例無FXSgt族史妊婦外周血檢測FM

10、R 1基因(CGG)n重復(fù) 序列PCFT增結(jié)果均見正常擴增帶，說明為非 FXS患者及FXS前突變 攜帶者；胎兒羊水細胞FMR 1基因檢測亦均見正常擴增帶。羊水細胞 的X Y同源牙幼基因PCFT增結(jié)果顯示，16例為男性胎兒，14例為 女性胎兒。2例FXS家系成員妊婦中，1例妊婦外周血FMR 1基因的 PCR結(jié)果見正常擴增帶，其胎兒羊水細胞檢測亦見正常擴增帶且為女 性，建議繼續(xù)懷胎；另1例妊婦外周血FMR 1基因檢出正常擴增帶和 前突變擴增帶，說明該妊婦為FXS前突變攜帶者，具胎兒未檢出擴增 帶，性別檢測為男性，提示該胎兒為男性 FXS患者，因為該妊婦已生 育一個FXS男性患者，故建議其終止懷胎。

11、FMR 1基因PCRT增結(jié) 果，見圖1。FXS是一類嚴(yán)峻阻礙兒童智力發(fā)育的遺傳性疾病，患者表現(xiàn)為程度不等的智力低下、語言及運算障礙和行為問題。自 20世紀(jì)40 年代初期FXS發(fā)覺以來，人們一直致力于該病的臨床診斷與產(chǎn)前診 斷研究。初期對FXS的診斷采納細胞遺傳學(xué)檢測位于 Xq27.3對葉酸靈 敏的脆性位點，可是由于該方式檢出率較低，容易造成誤診和漏診3。 1991年Verkerk等1發(fā)覺了 FXS的致病基因（FMR 1）,為FXS的分 子生物學(xué)診斷奠定了基礎(chǔ)。目前經(jīng)常使用的有兩種方式：PCR和Southern印跡。Southern印跡因其操作繁復(fù)，費時耗力，花費高而不 宜作為臨床經(jīng)常使用的檢測

12、診斷方式。PCR具有簡單、靈敏和快捷等優(yōu)勢，已普遍用于診斷FXS而且由于其所需DNAa少，也是FXS產(chǎn) 前診斷的首選方式4。本研究中應(yīng)用PCRt接擴增（CGG）n重復(fù)序列，對FXS進行了 篩查與診斷。針對擴增模板CG含量高且（CGG）n重復(fù)序列長，易形成 穩(wěn)固的二級結(jié)構(gòu)，變性不完全而致使 PCFT增失敗的問題，采納高保 真Golden TaqDNA聚合酶代替一般的 Taq酶。Golden TaqDNA聚合酶 具有較高的耐高溫性，因此，本研究把預(yù)變性溫度提高至98 c并延續(xù)10 min ,使CG含量高的模板充分變性。而且 Golden TaqDNA聚合 酶高保真率高，可糾正DNAT增進程中產(chǎn)生的

13、錯誤，取得更好的擴增 成效。關(guān)于PCFT物檢測，本研究采納聚丙烯酰胺凝膠電泳，它比瓊 脂糖凝膠電泳靈敏度高，污染小，檢測成效好。脆性X綜合征的發(fā)病率較高，男性約為1/1 250,女性為1/2 500,女性攜帶者高達1/3501/7005。FXS具有獨特的遺傳規(guī)律， 屬X連鎖半顯性遺傳，男性外顯率為 80 %女f生為30 %但女性攜帶 者在傳代進程中易發(fā)生(CGG)n重復(fù)序列的進一步擴展，發(fā)病風(fēng)險呈逐 代遞增趨勢6。Pesso等7報導(dǎo)在不明緣故智力低下家族史背景人 群中FXS前突變者攜帶者的比例高達1/70 ,而且前突變者在傳代進程 中發(fā)生全突變擴展的比例也較高，因此提出對育齡婦女進行FXS篩查

14、是必要的。中國人口基數(shù)大，F(xiàn)XS患者及前突變攜帶者總量相對較高， 因此有必要對脆性X綜合征進行篩查，而且篩查與診斷方式應(yīng)具有準(zhǔn) 確、簡便、費用低廉的特點以適合中國國情。本研究采納PCRt接擴增FMR 1基因(CGG) n重復(fù)序列，對30例無FXS家族史妊婦和2例 FXS家系成員妊婦及其胎兒進行FXS篩查，檢出1例妊婦為前突變攜 帶者，1例胎兒為患者。由于FXS男性發(fā)病率高于女性，本研究同時 采納PCRT增牙幼基因?qū)μ旱男詣e進行了檢測，證明胎兒為男性患 者。應(yīng)用PCRT增牙幼基因檢測性別靈敏度和特異性極高，從而保證 了胎兒性別測定的準(zhǔn)確性和靠得住性。本研究成立了穩(wěn)固的PCRTtF FMR 1基

15、因的(CGG) n重復(fù) 序列，結(jié)合PCRT增牙幼基因作為性別鑒定方式，用于脆性 X綜合征 的產(chǎn)前篩查與診斷。該方式操作簡便、快速、費用低，具有良好的臨 床應(yīng)用價值。對可疑育齡婦女可通過上述方式對其中的脆性X綜合征攜帶者及患者進行篩查，從而為患者提供遺傳咨詢。（圖1見封3）【參考文獻】IVerkerk AJ , Pieretii M, Sutcliffe J,et al.Identification of a gene(FMR 1)containing CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length

16、 variation in fragileX syndromeJ. Cell,1991,65(5):905914.2Fu YH, Kuhl DP, Pizzuti A, et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability, resolution of the Sherman paradoxJ. Cell, 1991,67(6): 10471058.3李東至，廖燦.脆性X綜合征J.中國優(yōu)生與遺傳雜 志,2005,13(5):121123.4曾靜，王和.脆性X綜合征的遺傳學(xué)診斷與產(chǎn)前診斷J.中 國優(yōu)生與遺傳雜志,2006, 14(5): 46.5陳敬春，楊愛德.脆性X綜合征的研究概況J.國外醫(yī)學(xué)婦幼保健分冊,1997, 8(2): 6467.6Castellv i-Bel S, Mil a M, Soler A, et al. Prenataldiagnosi