生物實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、精品文檔實(shí)驗(yàn)四 定量 PCR 擴(kuò)增姓名：李宗翰專業(yè)：環(huán)境工程學(xué)號(hào)： 1432999 同組人姓名：劉雪飛一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹?fù)習(xí)定量PCR 原理，熟悉絕對(duì)定量的操作流程二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，通過(guò)Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析三、實(shí)驗(yàn)儀器及材料real time PCR儀（ABI7500, RotorGene 3000）,微量移液器，Tip 頭，0.2ml 光學(xué)薄 壁管，8聯(lián)PCR管，1.5

2、ml離心管，SYBR Mix,引物及108 copy/ul標(biāo)準(zhǔn)品 四、實(shí)驗(yàn)步驟1、標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋：取4 個(gè) 1.5ml 的離心管，寫上標(biāo)記107，106, 105, 104，向每管加入90仙l ddH2O,取10屋108 copy/ul的標(biāo)樣加入到107管中，充分混勻 后，從管中取10履107 copy/ul的液體到106管中。按上述操作依次稀釋，得到 5 個(gè)倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品。注意，每次稀釋都要換Tip 頭。2、配制預(yù)混液：取119仙l ddH2。、7屋引物4204f、7川弓I物4448r和7仙l Rox 到裝有175仙l SYBR Mix液的1.5ml離心管中，混勻。3、分裝預(yù)混液：取7 個(gè)小離

3、心管，分別標(biāo)記108、 107、 106、105、 104、 UNK（未知樣）、NTC （陰性對(duì)照）。向其中分別加入42履預(yù)混液和4.7仙l模板（1-5 號(hào)加標(biāo)樣、6 號(hào)加未知樣、7 號(hào)加等量ddH2O） ，混勻。4、戴上手套取兩個(gè)8聯(lián)管，并排放置管架上。分別取上述樣品20履至第1-7管中 （第 8 管空出） ， 每個(gè)樣品兩個(gè)重復(fù)，共 14 個(gè)樣品。 將加好樣的8 聯(lián)管振蕩。5、設(shè)置分析儀參數(shù)如下：95 C 3min； 95 C 15s+60c 40s為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)次 數(shù)40,融解曲線溫度范圍6095C。振蕩好的卞品進(jìn)機(jī)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。6、擴(kuò)增后利用軟件分析Ct值及未知樣的定量結(jié)果。精品文

4、檔五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何？試分析答：實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如下。WellA1A2B1B2C1C2D1D2E1E2F1F2G1G2(1)、實(shí)驗(yàn)具體數(shù)據(jù)見卜表QuantityCtTaskCtCt MeanCt SDQuantityMeanQuantity SDThresholdSTANDARD8.24888.25270.00551000000000.0712STANDARD8.25658.25270.00551000000000.0712STANDARD11.389311.65980.3825100000000.0712STANDARD11.930311.65980.3825100000000

5、.0712STANDARD15.329214.96680.512610000000.0712STANDARD14.604314.96680.512610000000.0712STANDARD19.491219.30800.25901000000.0712STANDARD19.124919.30800.25901000000.0712STANDARD22.538522.41960.1681100000.0712STANDARD22.300722.41960.1681100000.0712UNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.6250.0

6、712UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.6250.0712NTC32.53290.0712NTC32.95490.0712其中，A-E為標(biāo)準(zhǔn)樣品，F(xiàn)為位置樣品，G為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品做兩個(gè)平行。通過(guò)軟件分析，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的未知樣品的定量結(jié)果約為5.83X 107。(2)、擴(kuò)增曲線*即I肥*lunPklQt。QQIOQ 1BIF B!II!VB1-IA 。且中3速訪前我W點(diǎn)國(guó)里里N道Cdt 4 目立口wf ,后h從擴(kuò)增曲線中可以看出，樣品均經(jīng)歷了良好的擴(kuò)增過(guò)程。精品文檔tomIOKK1CKKKK：WEKKDQIKKDOQaIXXK

7、KDCiCD10CXEOC uanllMI Eluinduid Unknown UrikriDwrMF用sW)吁0 996 Eff% = 29 6MS從標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以看出，R2值較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線可以使用。但擴(kuò)增效率一般。其(3)、標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard Curvs中106和107的兩個(gè)平行樣的CT偏差較大，這一現(xiàn)象可以從(1)表中看出，其SD分別為0.5126和0.3825,相比其他點(diǎn)較大，一般認(rèn)為 SD大于0.5不理想。(4)、融解曲線-?圭而圖中，可以看出每條曲線均為單峰且在一個(gè)合理的溫度范圍內(nèi)(8286C),所以擴(kuò)增是正常的，不存在非特異性擴(kuò)增。2、 實(shí) 驗(yàn)過(guò)程中需要注意些什么細(xì)節(jié)？答：

8、 （ 1） 、操作過(guò)程中盡量不要說(shuō)話，以避免污染；、 用微量移液器加樣品時(shí)應(yīng)保證槍頭深入液面以下，這樣樣品不會(huì)留在管壁上；、不能在定量PCR 管做標(biāo)記，裸手不可以接觸定量PCR 管，操作時(shí)應(yīng)戴手套。、 8 聯(lián)定量 PCR 管加完樣后，可先將蓋子放上，等放到振蕩機(jī)上再把蓋子蓋緊。3、通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)阌惺裁词斋@？這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)你今后開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究是否有幫助？答：通過(guò)實(shí)驗(yàn)我加深了對(duì)定量 PCR的理論認(rèn)識(shí)，熟悉了實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的操 作流程。這一實(shí)驗(yàn)對(duì)我今后研究環(huán)境問(wèn)題的微生物活動(dòng)方面是有幫助的。六、思考題如果你自己的試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效率是0.76、 1.52或 0.99, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果能用嗎？如果結(jié)果不能用，請(qǐng)說(shuō)明原因，怎么樣改變實(shí)驗(yàn)來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題？答：擴(kuò)增效率的有效值分兩個(gè)范圍，寬范圍在0.8-1.2之間，窄范圍在0.9-1.1 之間。如題，若實(shí)驗(yàn)得到的擴(kuò)增效率為0.76 或1.52，均在寬范圍之外嗎，則說(shuō)明擴(kuò)增不太理想，數(shù)據(jù)不能直接用?？梢酝ㄟ^(guò)刪除某些偏差較大的點(diǎn)來(lái)提高擴(kuò)增效率