臨床微生物實驗室規(guī)范化管理

1、關(guān)于臨床微生物實驗室規(guī)范化管理第一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床微生物學所面臨的挑戰(zhàn) （一）新傳染病的不斷出現(xiàn) 使臨床對感染性疾病的診斷和治療陷入了困境 （二）多重耐藥細菌的出現(xiàn) 隨著抗生素的廣泛應用，我國已經(jīng)提早步入抗生素高水平耐藥的國家行列，某些菌株的耐藥性甚至位居全球之首 第二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月及時、準確的病原菌診斷正確的形態(tài)學分析與病原鑒定，具備疑難病原確認技術(shù)細菌耐藥性監(jiān)控標準的抗藥性檢測與結(jié)果解釋醫(yī)院感染的監(jiān)控 能快速反應醫(yī)院感染與應急事件 必須規(guī)范臨床微生物實驗室的管理臨床微生物室所面臨的任務(wù)第三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月國

2、際上實驗室的規(guī)范化標準美國國會的臨床實驗室改進法案修正案1988（簡稱CLIA88）法國政府也于1999年11月發(fā)布了NOR：MESP9923609A關(guān)于正確實施醫(yī)學生物分析實驗的決議。 ISO 15189醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的具體要求第四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月衛(wèi)生部于2006年6月1日頒布 醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法2008年31家醫(yī)院實驗室通過認可ISO15189醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的專用要求我國實驗室規(guī)范化管理進程第五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床實驗室管理辦法第一章 總則 （5條）第二章 實驗室管理的一般規(guī)定 （16條）第三章 實驗室質(zhì)量管理 （11

3、條）第四章 實驗室安全管理 （11條）第五章 監(jiān)督管理 （9條）第六章 附則 （4條）第六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 技術(shù)要求5.1 人員5.2 設(shè)施和環(huán)境條件設(shè)施5.3 實驗室的設(shè)備5.4 檢驗前程序5.5 檢驗程序5.6 檢驗程序的質(zhì)量保證5.7 檢驗后程序5.8 結(jié)果報告ISO 15189醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的專用要求第七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月ISO15189認可與微生物實驗室 ISO15189醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的專用要求按照其質(zhì)量管理體系要求，改進檢驗流程、規(guī)范實驗操作、提高檢測能力，使每項微生物檢驗技術(shù)與診斷報告可追溯到體系的源頭，為客戶提供

4、準確、快速、安全、經(jīng)濟的微生物專業(yè)診斷服務(wù). 既從病人準備、標本采集、標本傳遞與方法選擇，到診斷報告得出、結(jié)果解釋與指導臨床的標準化過程. 第八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月參考CLSI 文件從以下7方面提出建議標本采集和運送的基本規(guī)范；培養(yǎng)前標本質(zhì)量檢測基本規(guī)范標本分離的基本規(guī)范細菌鑒定基本規(guī)范；細菌藥物敏感試驗基本規(guī)范；實驗室質(zhì)量保證基本規(guī)范；細菌報告基本規(guī)范； 第九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一.標本采集和運送標本采集和運送是細菌培養(yǎng)成功的最最重要的關(guān)鍵微生物人員和臨床醫(yī)護人員一道，根據(jù)臨床微生物檢驗規(guī)范的規(guī)定，研討和制定本院微生物標本采集、保存和運送的具體要求

5、。要廣泛宣傳，認真實施，建立健全標本驗收制度，對于不合格的標本要堅決退回，說明原因，要求重送。第十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月美國與歐洲對實驗室的新要求NCCLS M40 標 準 DIN 58942 標 準 第十一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1.痰標本的采集和運送 1. 標本采集時間：用抗生素前2. 采集方法：自然咳痰：必須用請水漱口3次，應包括咽喉部，立即用力咳出痰，于滅菌容器中或輸送培養(yǎng)基中。支氣管鏡或支氣管毛刷:由醫(yī)生采集，建議直接種入輸送培養(yǎng)基第十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2.泌尿標本的采集和運送 1采集后的標本應立即送檢。2采集時間：多數(shù)

6、藥物從尿道排泄，所以不管用哪種方法都應在用藥前采集。應采集早晨第一次的尿。3 標本管不應含防腐劑和消毒劑。4.長期留置導尿管的患者應在更換新管時留取尿標本。5. 做厭氧培養(yǎng)時應膀胱穿刺采集尿。第十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.分泌物的采集和運送 1. 對開放性病灶的采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。2. 閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常采用穿刺或引

7、流的的方法采樣，應在用藥前采集，應注意膿液的氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時送檢應應用輸送培養(yǎng)基。第十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.便標本的采集和運送 1.采集時間：腹瀉患者應在用藥前、急性期采集；沙門菌感染、腸熱癥應在2周內(nèi)采；厭氧菌出現(xiàn)癥狀即采集。2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有膿血和黏液的部位的糞便2-3克，如液狀糞便取絮狀物盛于無菌的、密封的、不吸水的、容器內(nèi)或直接盛于增菌液或保存液中；對不易獲得糞便患者及幼兒，可用直腸拭子采集后置保存液或輸送培養(yǎng)基中送檢。第十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月便標本的采集和運送 注意事項：雖然糞便標本

8、本身含很多細菌但也要用無菌容器。在患者病情許可的條件下應在用藥前采集標本。應床邊接種或置輸送培養(yǎng)基送檢。厭氧細菌（難辯梭菌）培養(yǎng)的標本應盡量減少與空氣接觸。第十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月5.厭培養(yǎng)標本的采集和運送 1.痰標本的厭氧培養(yǎng)標本采集：必須用氣管穿刺法獲得痰液，從口腔吐出的痰標本不能用于厭氧培養(yǎng)。2.尿標本的厭氧培養(yǎng)標本采集：恥骨上膀胱穿刺獲得尿標本可用于厭氧菌培養(yǎng) 3便標本厭氧培養(yǎng)標本采集： 可用排出的便做厭氧培養(yǎng)但也應少與空氣接觸。第十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 6.血液及骨髓標本的采集和運送 1.采血時間：盡可能在用抗生素前，心內(nèi)膜炎例外。2.

9、 采血量：至少應采一套2瓶，分需氧和厭氧。血量按培養(yǎng)瓶要求，先將1注入需氧瓶，再將剩余血注入?yún)捬跗俊?. 采血方法：不要與血氣和血沉標本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導管或靜脈留置口采血。第十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月血液及骨髓標本的采集和運送 4.采血間隔：如第一次采集2套（4瓶）血培養(yǎng)標本，在以后的2-5天不必采血，但除外心內(nèi)膜炎和導管相關(guān)性敗血癥。5. 兒童：采血量是總血量的1%。6.延遲培養(yǎng)瓶處理: 延遲培養(yǎng)瓶不要放冰箱或孵箱，放常溫，盡早送往臨床細菌室。7.皮膚消毒液推薦：建議先用70-80%異丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。第十

10、九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二.標本培養(yǎng)前的基本規(guī)范1.痰培養(yǎng)標本實驗室在接種前必須作痰涂片革蘭染色，當在低倍鏡下白細胞25個/LP時應作為不宜做培養(yǎng)的標本；當白細胞 10個/LP，上皮細胞20個/油鏡或該菌占所見到細菌的50%,可推測是標本中的優(yōu)勢細菌.第二十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 有了合格的標本是保證培養(yǎng)成功的重要條件，但如果沒有適宜的分離培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境同樣不能獲得好的結(jié)果，為此制定如下基本條例以保證致病細菌分離成功。三.分離培養(yǎng)基本規(guī)范第二十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1.痰培養(yǎng)1培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭瓊脂

11、或伊紅美蘭、或加MRSA顯色瓊脂。2培養(yǎng)環(huán)境：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、置5-7%CO2、35環(huán)境培養(yǎng)，其他培養(yǎng)基置35空氣培養(yǎng)。3結(jié)核培養(yǎng)：羅氏雞蛋斜面，每一標本種2支，37空氣培養(yǎng)。第二十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2.尿標本 1培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭，或CP3尿致病菌分離顯色瓊脂。2.菌落計數(shù)：每個標本都要做，用加樣器或定量接種環(huán)取樣本10ul分別接種于上述培養(yǎng)基均勻涂布整個平皿，此日作菌落計數(shù)。3培養(yǎng)環(huán)境：35空氣環(huán)境培養(yǎng) 第二十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.便培養(yǎng) 1培養(yǎng)基：中國蘭或伊紅美蘭，沙門氏志賀氏瓊脂（SS瓊脂）或加沙

12、門菌分離瓊脂。2培養(yǎng)環(huán)境：35空氣環(huán)境培養(yǎng)。3疑似偽膜性腸炎：5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂斜面、梭狀芽孢桿菌分離瓊脂（CCFA）。5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂斜面置35空氣環(huán)境培養(yǎng)。CCFA置35厭氧環(huán)境培養(yǎng)。其他特殊腸道致病菌培養(yǎng)按國家CDC要求執(zhí)行。 第二十九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.腦脊液培養(yǎng) 1培養(yǎng)基：5%兔血巧克力瓊脂、5%羊血瓊脂。 2培養(yǎng)環(huán)境：35，5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)。第三十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月5.分泌物培養(yǎng) 1培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、 中國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯2培養(yǎng)環(huán)境：35空氣環(huán)境培養(yǎng)。第三十一張，PPT共六十五頁

13、，創(chuàng)作于2022年6月6.膽汁或胸水或腹水 1培養(yǎng)基：如標本量大時可按血液培養(yǎng)方法直接取16-20ml分別種入需氧和厭氧培養(yǎng)瓶。如標本量有限，可接種5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯。2培養(yǎng)環(huán)境：35空氣環(huán)境培養(yǎng)。第三十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四.細菌鑒定規(guī)范操作1. 涂片染色一涂片染色：應具備最基本的兩種染色技術(shù)，即革蘭氏染色和抗酸染色。1 革蘭染色：革蘭染色報告必須包括染色反應或微生物種類和類別，描述物種的形態(tài)或結(jié)構(gòu)。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。第三十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年

14、6月涂片染色 2.抗酸染色：抗酸染色報告應顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，報告中應以加號體現(xiàn)標本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌+；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標本。不能報告找到結(jié)核桿菌但可報告未找到結(jié)核桿菌第三十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 趨向性鑒定試驗 革蘭陽性球菌:觸酶試驗:3%H2O2用30%的H2O2稀釋10倍后使用，避光4度保存 ；試驗時設(shè)立陽性和陰性對照；1分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡為陽性。凝固酶試驗：采用商品試劑或EDTA抗凝的多個兔混合血漿；測定玻片法測定凝聚因子10秒鐘即可觀察結(jié)果；測定凝固酶需在37度3-4h，若陰性還應放置24h再觀察結(jié)果。

15、第三十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月革蘭陰性桿菌:氧化酶試驗 建議用紙片法保存比較方便；試劑配制：1%鹽酸四甲基對苯二胺水溶液陽性：由粉紅變?yōu)樗{紫色為陽性對照：銅綠假單孢菌 ATCC 27853 + 大腸埃希菌 ATCC25922 - 第三十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.血清學試驗 腸道致病菌生化特征符合的前提下必須有血清學的試驗作最后確認，基層細菌室應具備1-3項血清試劑。 1.志賀氏菌多價和單價凝集血清：2.沙門氏菌多價和單價凝集血清3.致病性大腸桿菌多價和單價凝結(jié)血清第三十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.真菌鑒定1每一基層實驗室必須開展真菌

16、涂片，報告臨床是否找到真菌；是否見到真菌菌絲；從形態(tài)辨別常見絲狀真菌;區(qū)別曲菌或毛霉菌。2開展酵母樣真菌分離培養(yǎng)，應具備最基本的沙保弱培養(yǎng)基或用顯色培養(yǎng)基，鑒別白念和非白念，隱球菌等。3.有條件的實驗室應開展非培養(yǎng)的鑒定方法，如-D葡聚糖的檢測。第三十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月五.藥敏試驗的規(guī)范操作 1. 用CLSI指南推薦的KB藥敏標準進行常規(guī)藥敏試驗判斷。2.根據(jù)CLSI更新及時替換應用的標準。3.根據(jù)CLSI推薦的方法，開展重要耐藥菌的檢測，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。第三十九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 紙片擴散法AST操作步驟 制備接種物

17、（0.5麥氏單位） 接種（15分鐘內(nèi)接種，涂抹均勻） 在接種好的瓊脂平板上貼加紙片 孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35C空氣孵育） 苛養(yǎng)菌5CO2孵育 判斷結(jié)果和解釋結(jié)果第四十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月AST紙片擴散法 判讀結(jié)果 將游標卡尺置于反轉(zhuǎn)的平板的背面，測量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應距離一個黑色不反光的背景，并用反射光照明。 如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基，則應在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測量抑菌圈。 如果被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應孵育24小時，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內(nèi)有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長。第四十一張，PPT共六十五頁

18、，創(chuàng)作于2022年6月ESBL初步篩選實驗頭孢泊肟 10ug or 頭孢他啶 30ug氨曲南 30ug or 頭孢噻肟 30ug頭孢曲松 30ug 藥敏紙片頭孢泊肟抑菌圈 =17mm* 頭孢他啶抑菌圈 =22mm氨曲南抑菌圈 = 27mm 頭孢噻肟抑菌圈=27mm頭孢曲松抑菌圈 127Cefotaxime NANAAztreonam122Ceftazidime1*22*Cefpodoxime稀釋法 (g/ml)紙片擴散法 (mm)Drug*P. mirabilis 不同于其他菌 (比如 17 mm and 4 g/ml for E. coli and Klebsiella spp.); NA,

19、 不適用 CLSI M100-S16; Table 2A (M2, M7)43NEW第四十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月ESBL確認試驗第四十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月ESBL的質(zhì)控頻率篩選試驗和表型確證試驗均可每日進行或每周進行，所選擇菌株為肺克700603或大腸埃希菌25922。 應該注意的是：肺克700603ESBL基因在質(zhì)粒上，應將其凍存于-60或以下。第四十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月可誘導的克林霉素耐藥 (erm-介導)常規(guī)D試驗: 陽性 15 g 紅霉素紙片及 2 g克林霉素之間距離為15-26.“D Test” 陽性反應 第四十六

20、張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2006強調(diào)mecA介導的葡萄球菌耐藥的表型試驗 紙片擴散法 用頭孢西丁 (CX DD 30 g) 紙片金葡菌 其結(jié)果等于苯唑西林紙片(OX DD)結(jié)果。CoNS 結(jié)果優(yōu)于苯唑西林紙片的結(jié)果。結(jié)果清晰，讀起來比苯唑西林容易。報告時仍寫苯唑西林，而不寫頭孢西丁。MIC試驗 仍用苯唑西林藥。43第四十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 Confirmatory Tests for Suspected Carbapenemase Production in Enterobacteriaceae 2009第四十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年

21、6月需證實藥敏試驗的結(jié)果和確認菌種的鑒定第四十九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月CLSI 在表格的導言中對ESBL增加了警告 “Warning” 條文NEW第五十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月六.質(zhì)量控制的規(guī)范化1藥物敏感試驗的質(zhì)量控制：應包括30天的初始質(zhì)量穩(wěn)定測試；每周一次的常規(guī)質(zhì)量控制；5天的糾控程序。2鑒定試劑質(zhì)量控制：購入新的試劑；在更換批號；更換生產(chǎn)廠家；結(jié)果發(fā)生異常等情況時均應進行質(zhì)量控制。3染色液質(zhì)量控制：每天臨床標本染色前應包括染色結(jié)果陽性和陰性的對照物及染色液污染的質(zhì)量檢查。第五十一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)量控制內(nèi)容4分離培養(yǎng)基：如

22、血瓊脂和巧克力，用肺炎鏈球菌、B-溶血和草綠色溶血的鏈球菌、流感嗜血桿菌、等苛養(yǎng)細菌的標準菌株或經(jīng)標準化試劑已證實結(jié)果正確的菌株進行測試，判斷其分離能力。5.培養(yǎng)箱溫度的質(zhì)量控制：每天第一個開箱和最后離開實驗室均應對培養(yǎng)箱的溫度作記錄；CO2培養(yǎng)箱還應記錄CO2的含量。 第五十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)量控制內(nèi)容6冰箱溫度記錄：按每一冰箱存放的物品不同設(shè)置不同的質(zhì)控范圍，特別對低溫冰箱；每天記錄一次。7自動化設(shè)備：按廠家提供的SOP文件進行質(zhì)控；在設(shè)備軟件升級或修改版本時均應進行質(zhì)量控制程序。8.每一有權(quán)向臨床發(fā)報告的實驗室都應參加全國或省或市級質(zhì)量控制活動。第五十三張，P

23、PT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細菌實驗室應對不同的細菌檢驗報告時間和內(nèi)容應有相應的規(guī)定，并告訴臨床各科，依此可防止不明原因的報告延遲應分兩種報告形式：1.危重感染報告:2.常規(guī)報告:七.臨床細菌室報告制度的規(guī)范第五十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.涂片報告1.革蘭染色： 危急報告30分鐘報告。 報告內(nèi)容應包括染色反應、是細菌或真菌、細菌形態(tài)。有無細胞內(nèi)吞嗜現(xiàn)象，有無菌絲。2.抗酸染色：報告抗酸染色陽性或陰性；菌量以加號表示。 常規(guī)報告24h,危重報告1h2。第五十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2.血液和無菌體液培養(yǎng)的報告制度 實行三級報告制度：第一級：培養(yǎng)液直接涂片結(jié)果；第二級：初步藥敏結(jié)果和平皿菌落涂片結(jié)果；第三級：正式細菌鑒定和藥敏報告。第五十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.便培養(yǎng)24小時可發(fā)出初始報告;72小時應報告藥敏試驗結(jié)果；根據(jù)檢測范圍報告檢測結(jié)果，如未檢測出沙門菌、志賀菌