如何理解測序蜂圖

1、測序峰圖測序方法現(xiàn)代DNA序列測序可分為一二三代。一代測序第一代測序技術(shù)包扌舌鏈終止法和化學(xué)降解法，其主要特點(diǎn)是以待測DNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)規(guī)則采用DNA聚合酶體外合成新鏈。由于新鏈中滲入了帶有標(biāo)記的堿基類似物，可用于制備末端帶有標(biāo)記的DNA單鏈。這些末端帶有標(biāo)記的DNA單鏈?zhǔn)且粋€群體，在凝膠電泳時可以形成彼此僅差一個堿基的梯形條帶。根據(jù)末端堿基的特有標(biāo)記可以讀取待測DNA的序列組成。鏈終止法（Sanger法）反應(yīng)分別在4個試管中進(jìn)行，每一試管中都含有：待測的DNA單鏈片段，作為模板；DNA聚合酶：序列已知且與模板3,端互補(bǔ)的引物：四種脫氧核昔三磷酸（dATP、dGTP、dCTP和dTTP

2、）:四種雙脫氧核苛酸中的一種，作為DNA鏈合成的末端終止劑。在適當(dāng)條件下進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，由于新?lián)饺氲暮丝了嶂荒芡律淢端的-0H連接，而2；3-雙脫氧核甘三磷酸核糖基的2：3,位-0H的氧已脫掉，失去了和后來的核甘酸連接的可能性，這時堿基的摻入就有兩種可能性：dNTP摻入新生鏈，使鏈繼續(xù)延伸。2,3-ddNTP摻入，使新生鏈的合成終止。由于兩者摻入的幾率不同，就形成一套長度不一的DNA片段。最后通過A、T、G和C四組反應(yīng)的凝膠電泳放射自顯影圖譜，即可讀出所測樣品互補(bǔ)鏈的核苛酸序列。(D)ProductsofthefourreocttonsiTube1:ProductsofddAreacti

3、onTube3:ProductsofddCreactionTempiata(22)(2勺(27)TACTATGCCAGA6AT00ATGATTempiata(28)(32)Tube2-ProductsofddGreadionTube4ProductsorddTregionTempiata(24)(30)TACTATGCCAGAATATGATACATGATACGTempiata-(23)(26J(31)(33)TACTATGCCAGAATGATAATGATACGGTTACTATGCCAGAMScatqaQatgatacggATGATACGGTCO要求測序時使用的DNA聚合酶不能有寧3外切酶活性（

4、可將新合成DNA鏈的5一末端除去核昔酸而改變鏈的長度）、3=8外切酶活性（可將錯配的堿基除去，再補(bǔ)上正確配對的核苛酸）。這兩種活性會產(chǎn)生干擾條帶。DMA聚合関合成“NA引物DNA聚合的II535模板DNA5535。3外切核駿酶活性使DNA聚介醉可切除已存在的5單鏈35533*5外切核酸觴活性可使DNA聚合醐校正3錯配的孩甘酸亡一銷配的核昔酸5355535335熒光染料標(biāo)記物在Sanger法中的應(yīng)用目前己發(fā)現(xiàn)具有不同熒光色彩的標(biāo)記化合物，可將其分別與指定的ddNTP結(jié)合，如ddATP標(biāo)記綠色熒光，ddCTP藍(lán)色熒光，ddTTP紅色熒光，ddGTP黑色熒光。這四種標(biāo)記的ddNTP混合加入到一個反應(yīng)

5、中，聚合鏈終止反應(yīng)完成后，可以獲得末端分別帶有A、C、T和G的DNA單鏈。毛細(xì)管電泳帶電粒子在電場力的驅(qū)動匚在毛細(xì)管中按其分配系數(shù)不同進(jìn)行高效.快速分離的電泳技術(shù)。樣品木電解液屮泳動，根據(jù)物質(zhì)的荷/質(zhì)比差并來進(jìn)行分離，比值愈人，跑得愈快(b)ElstroDhoresis:DetectorAGACCGTATCATFluorescentightemittecbybandTocomputerAAACGTACAACTTTTACTATGGCGTG304050v測序峰圖峰圖是以4種顏色連續(xù)的峰型圖代表A、T、G、C4種堿基序列的圖。峰的高低說明了信號的強(qiáng)弱，寬窄表示的是分離效果，町以對比板膠電泳的亮度和條

6、帶的寬窄。重疊則說明了樣品中有長度相同但是序列不同的片段。概念：讀長：序列讀取的堿基長度，峰圖上方橫向顯示的數(shù)字。信號：測序序列是通過對不同堿基所攜帶的不同顏色的熒光信號翻譯所得，熒光信號的強(qiáng)弱是我們常說的信號。成功峰圖？峰型：尖銳、對稱、無底峰；讀長：800bp可信；信號：正常（lk20k）,走勢平緩下降。測序峰圖中可能存在的問題w峰型問題可信讀長問題信號問題雙峰非單克隆特征：從插入位點(diǎn)開始雙峰或某個位置開始雙峰。處理方法：重新挑單克隆測序。雜合(突變)特征：峰圖中某些位置雙峰。Figure1SNPFigure2雜合缺失特征：從堿基缺失位置出現(xiàn)移碼。移碼-底峰序列表現(xiàn)為主峰向左或向右移動后的

7、序列。引物問題(YM)：引物合成不純或降解特征：序列一開始就出現(xiàn)移碼現(xiàn)象處理方法：重新合成引物再測序結(jié)合問題(JH)特征：(1)一開始就是雙峰，在某一點(diǎn)終止或從頭到尾雙峰可能原因：模板上有2個或2個以上以上引物結(jié)合位點(diǎn)、模板或引物不純。處理方法：重新制備樣品或設(shè)計(jì)特異引物測序夾峰:模板量高特征：峰圖中兩峰之間夾有小雜峰，一般不影響主峰的讀取，在信號圖中表現(xiàn)為反應(yīng)信號過高。處理方法：直接或稀釋重跑，降低模板量測序?qū)挿蹇赡茉颍耗０宀患兓騊0P7膠中有氣泡處理方法：重跑底峰不干凈特征：信號圖中基線不齊或信號弱可能原因：模板純度不好，有雜質(zhì)；模板量偏低或反應(yīng)進(jìn)行不充分處理辦法：重新純化或重送樣；加量

8、重做或重送樣引物峰及引物二聚體峰特征：在20-30、40-60bp堿基處有高信號的峰形成，之后信號可能衰減。處理方法：重新合成引物或重新設(shè)計(jì)引物測序。引物形成二聚體致使反應(yīng)無信號干擾峰（染料峰）和酒精峰特征：4個干擾峰固定出現(xiàn)在30、40、70、llObp附近。處理方法：重新測序降解峰特征：在220、450bp附近G堿基降解，峰型擴(kuò)散。處理方法：若不影響堿基判讀不安排調(diào)整，否則安排重新測序。重復(fù)序列（CF）特征：單堿基或兩個以上堿基重復(fù)出現(xiàn)，導(dǎo)致后續(xù)峰圖可能移碼或亂峰。處理方法：因重復(fù)未測到的序列，建議加測反向補(bǔ)拼。高GC（GC）特征：序列局部堿基GC富集，之后可能信號衰減，峰圖變亂?；匚慕Y(jié)構(gòu)及其他結(jié)構(gòu)（JG）特征：信號衰減或中斷，峰圖變亂。處理方法：最好選用GC優(yōu)化程序。無信號特征：峰圖表現(xiàn)為雜亂無章。形成原因：引物和模板不能正常結(jié)合反應(yīng)，包括漏加，加錯，有影響結(jié)合或影響反應(yīng)因素。處理方法：菌液用通用引物測無信號的安排重新?lián)u菌、自帶引物無信號建議通用引物測序；質(zhì)粒、per測序無信號的不調(diào)整，建議客戶重新送樣，若失敗較多的挑幾個重測，并跟客戶說明情況在進(jìn)行DNA測序時，緊接引物的1030堿基有時不一定能完全讀清楚。引自Molecularbiolog