基因操作原重難點(diǎn)總結(jié)

1、基因操作原理重難點(diǎn)總結(jié)基因克隆的宏觀策略：答:已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目標(biāo)基因)：根據(jù)已知基因序列信息設(shè)計引物，以基因組DNA為模板，擴(kuò)增出目標(biāo)基因；定位在質(zhì)粒上的基因克隆：利用識別六堿基的限制性內(nèi)切酶酶解質(zhì)粒DNA,電泳分離，然后用特異探針進(jìn)行雜交，確定基因片段進(jìn)行克?。欢ㄎ辉谌旧w組上的基因克?。弘s交方法：i.用識別四個堿基的限制性內(nèi)切酶對染色體DNA進(jìn)行部分酶切，建立基因文庫。再用標(biāo)記特異探針進(jìn)行探測，確定目標(biāo)基因片斷，再進(jìn)行克隆。ii.利用亞基因文庫進(jìn)行克隆先進(jìn)行分子雜交，確定基因片斷范圍，再進(jìn)行克隆篩選。免疫抗體法：利用鳥槍法和表達(dá)載體建立基因表達(dá)文庫；利用目標(biāo)蛋白

2、質(zhì)制備抗體，對基因表達(dá)文庫進(jìn)行篩選，可直接獲得完整的基因。利用簡并引物的PCR方法：對目標(biāo)基因的蛋白質(zhì)進(jìn)行N-端氨基酸殘基分析。根據(jù)氨基酸序列反推目標(biāo)基因設(shè)計簡并引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)座子插入失活克隆法：用轉(zhuǎn)座子對目標(biāo)生物進(jìn)行突變，篩選突變株，抽提突變株基因組DNA，利用轉(zhuǎn)座子序列信息設(shè)計特異探針，進(jìn)行TAIL-PCR雙向擴(kuò)增，從而獲得完整基因。質(zhì)粒拯救法：利用帶有復(fù)制起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行誘變獲得突變株，分離總DNA，酶解、連接、轉(zhuǎn)化和測序。功能克隆法(基因表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)有明顯的表型效應(yīng))：利用目標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物的表型效應(yīng)，從基因文庫中篩選目標(biāo)基因。通過雙雜交系統(tǒng)

3、克隆新基因：通過靶標(biāo)蛋白利用雙雜交系統(tǒng)克隆與該靶標(biāo)蛋白作用的蛋白質(zhì)基因。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)克隆基因：通過肽片斷序列獲得蛋白質(zhì)信息，從而在基因組中找到基因位置和序列，根據(jù)序列設(shè)計引物，擴(kuò)增克隆該基因。設(shè)計從某一生物中克隆某一基因的技術(shù)路線：答：原核生物：從樣品中抽提總DNA，部分酶切，構(gòu)建合適載彳一將目標(biāo)DNA片段與載體連轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞培養(yǎng)一一可以根據(jù)該目標(biāo)基因所表現(xiàn)出的特定表型篩選，或是利用核酸探針雜交法、抗體免疫法和差異雜交法篩選。真核生物：提取樣品總RNA并分離mRNA用反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第一鏈cDNA合成第二鏈cDNA雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖利用各種篩選

4、方法來篩選目的基因，如表型篩選法、雜交篩選、PCR篩選和免疫篩選。描述原核生物基因表達(dá)的基本元件：答：(1)啟動子：DNA序列中被RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等識別并結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域。Sextamabox:也稱-35序列，識別序列。其中心位于起始點(diǎn)上游大約35bp處。其共有序列為TTGACA.是RNA聚合酶的識別位點(diǎn)(Rsite)；Pribnowbox:也稱-10序列，在起始點(diǎn)的上游，其共有序列為TATAAT，是RNA聚合酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)(Bsite)，在Pribnow框內(nèi)DNA的雙螺旋解鏈17個核苷酸左右，與RNA聚合酶形成所謂開放性啟動子復(fù)合物，從而使RNA聚合酶定向，行使其轉(zhuǎn)錄

5、功能；轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)為+1位點(diǎn)(Isite)；這三個位點(diǎn)定義為核心啟動子。核心啟動子上游的-70-40區(qū)域含有與CAP-cAMP復(fù)合物結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄的正控制位點(diǎn)，即上游控制因子(USE)。核心啟動子與上游控制因子一起被統(tǒng)稱為擴(kuò)展的啟動子。終止子：一個或多個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，連續(xù)的6個U是RNA聚合酶從模板上解離下來的信號。根據(jù)體外試驗(yàn)中轉(zhuǎn)1/11 /11錄終止是否需要特定輔助因子Rho(p)的參與，又分為兩種：不依賴p因子的終止子和依賴p因子的終止子。SD序列：位于mRNA5端，被核糖體識別并結(jié)合的較為保守的核苷酸序列，在原核生物中該位點(diǎn)稱為SD序列，位于起始密碼上游310bp的位置，同16SrRNA3端的

6、序列互補(bǔ)。起始密碼子：AUG；終止密碼子：UAG,UAA,UGA；(6)調(diào)節(jié)基因：位于啟動子的上游，編碼調(diào)節(jié)蛋白，阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合阻止基因表達(dá)，誘導(dǎo)蛋白結(jié)合在啟動子區(qū)域，加強(qiáng)基因的表達(dá)。(8)操縱基因：與阻遏蛋白結(jié)合，終止轉(zhuǎn)錄。試述限制性內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)：命名和寫法也需要掌握。答：根據(jù)酶的組成、識別和切割的位點(diǎn)及是否需要輔助因子可將限制性內(nèi)切酶分為三類：II類限制性內(nèi)切酶占內(nèi)切酶的絕大部分，由修飾酶和切割酶組成，識別回文對稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA雙鏈，產(chǎn)生3，-OH和5，-P基團(tuán)的DNA產(chǎn)物，反應(yīng)需Mg2+不需ATP。不同限制性內(nèi)切酶識別和切割的特異性不同，結(jié)果有3種情況：

7、產(chǎn)生3,突出粘性末端。產(chǎn)生5,突出粘性末端，產(chǎn)生平末端，另外，有些限制性內(nèi)切酶還具有星星活性，即在極端的條件下，如高PH值和低離子強(qiáng)度下，限制性內(nèi)切酶可以切割類似但不同于其特定識別序列的序列。最常見的一類活性改變是允許堿基替代和識別序列中堿基的缺失。試述利用DpnI進(jìn)行定點(diǎn)誘變的原理和方法：答：限制性內(nèi)切酶DpnI用于定點(diǎn)誘變是因?yàn)樗商禺愋缘厍懈铍p鏈中的匸ATC位點(diǎn)，對半甲基化的DNA切割效率低，完全不能切割非甲基化DNA。PCR擴(kuò)增時，誘變引物與預(yù)發(fā)生突變的模板之間具有單個堿基的錯配，擴(kuò)增結(jié)果使錯配進(jìn)入到模板序列中。由于用4種dNTP在體外擴(kuò)增的產(chǎn)物不含有DpnI識別的甲基化位點(diǎn)，而模板質(zhì)

8、粒DNA在宿主體內(nèi)的內(nèi)源性Dam甲基化酶催化下已完全甲基化，所以DpnI就會切割消化模板DNA，而新擴(kuò)增的DNA則被保留。再以擴(kuò)增的DNA為模板合成其互補(bǔ)鏈，則互補(bǔ)鏈就為實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變的DNA。方法：加熱變性質(zhì)粒DNA，然后退火使含有突變位點(diǎn)的引物與質(zhì)粒DNA配對；熱循環(huán)擴(kuò)增摻入突變的引物，產(chǎn)生有缺口的環(huán)狀鏈；用DpnI降解模板鏈；將退火形成的有缺口的雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中；XL1-BlueE.coli細(xì)胞修復(fù)缺口，成為定點(diǎn)突變的質(zhì)粒DNA。定點(diǎn)誘變有哪些方法，其原理又是什么？答:寡核昔酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變：首先，合成能與野生型DNA模板的靶區(qū)域退火、并攜帶所需突變的寡核苷酸

9、，作為體外合成DNA的引物；其次，由DNA聚合酶根據(jù)模板序列延伸寡核苷酸，產(chǎn)生含有預(yù)定突變的雙鏈DNA。模板既可以是DNA片段，誘變合成后克隆到合適的載體上；也可以是完整的質(zhì)粒(v9kb)。模板既可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。最后，對突變體DNA進(jìn)行測序，驗(yàn)證靶點(diǎn)的突變，并確保其他區(qū)域沒有發(fā)生額外的突變。Kunkel定點(diǎn)突變：該方法通過產(chǎn)生帶尿嘧啶的DNA作模板，可高效率地篩選突變克隆。在制備單鏈模板時采用undu突變的大腸桿菌菌株，該菌株合成的DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代，在體外用含突變位點(diǎn)的誘導(dǎo)引物引導(dǎo)合成雜合的互補(bǔ)雙鏈DNA，然后再轉(zhuǎn)入正常undu菌株，帶尿嘧啶的野生型DNA鏈被尿嘧

10、啶-N-糖基化酶水解產(chǎn)生脫堿基位點(diǎn)，不再具備作為復(fù)制模板的能力，只有帶有突變位點(diǎn)的新合成鏈可以作為模板進(jìn)一步復(fù)制，這樣只有帶突變位點(diǎn)的細(xì)胞才能生長。位點(diǎn)選擇誘變：該法使用了2個寡核苷酸引物，一個是用來引入突變的突變引物，另一個是用來選擇用的。選擇性引物可用來恢復(fù)有缺陷的抗生素抗性基因，同時也用來選擇引入突變的DNA鏈。該方法需要特定載體一含有一個有缺陷的抗生素抗性基因。轉(zhuǎn)化子誘變：該方法也使用了2個寡核苷酸引物，除了突變引物外，還使用了一個用來剔除單一酶切位點(diǎn)的引物，故亦稱酶切位點(diǎn)剔除法。將待突變的DNA片段裝載到克隆載體上，該載體上必須存在一個單一酶切位點(diǎn)。當(dāng)這兩個引物同時指導(dǎo)DNA合成時，

11、突變的DNA鏈將不再含有該單一酶切位點(diǎn)，而模板DNA在該位置能被切割。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，線性化的模板DNA不能復(fù)制，只有突變鏈保持環(huán)狀，可以獲得轉(zhuǎn)化子。盒式誘變：是利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，連接到經(jīng)酶切除去待突變DNA片段的載體上，得到取代突變。待突變區(qū)域兩側(cè)要含有單一酶切位點(diǎn)，若沒有，可先通過定點(diǎn)突變方法引入合適的酶切位點(diǎn)。PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變：大引物PCR誘變：該方案需要1個內(nèi)部致突變引物和1對側(cè)翼引物，需經(jīng)過2次PCR反應(yīng)。側(cè)翼引物分別于待突變基因兩側(cè)匹配，內(nèi)部致突變引物與靶位點(diǎn)匹配。設(shè)計引物的解鏈溫度以及PCR反應(yīng)條件，使兩次PCR反應(yīng)能在同一只試管中進(jìn)行。第一次P

12、CR反應(yīng)中內(nèi)部致突變引物和側(cè)引物具有低L.值，使用低退火溫度；第二次PCR反應(yīng)直接在第一次PCR反應(yīng)之后加入另一個具有高：值的側(cè)引物，使用高退火溫度。最終將突變基因片段克隆到載體上。重疊延伸PCR誘變：該法需要1對內(nèi)部致突變引物和1對側(cè)翼引物，需要經(jīng)過3次PCR反應(yīng)。2個內(nèi)部致突變引物與模板DNA的不同鏈匹配，都含有預(yù)設(shè)突變。2個獨(dú)立的PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增出2個重疊的DNA片段，突變位點(diǎn)位于重疊區(qū)域；混合2個PCR反應(yīng)產(chǎn)物、或分別純化后再混合，變性、退火后進(jìn)行第三個PCR反應(yīng)，得到突變基因片段，再克隆到載體上。雙向PCR快速定點(diǎn)突變：只需要1對引物，經(jīng)過1次PCR反應(yīng)。要求2條引物間不重疊，但引

13、物的5端所對應(yīng)的序列在模板中是連續(xù)的。錯配堿基在引物的5端，引物3端至少有15個堿基與模板完全匹配，并且要求至少1個引物的5端磷酸化，以使PCR產(chǎn)物末端能連接?；虿僮髦谐Ｓ霉ぞ呙甘悄男?？各有什么用處？答：基因操作中最常用的修飾酶有：內(nèi)切酶和外切酶：識別特定的DNA序列，切割單鏈或雙鏈，產(chǎn)生黏性末端或平末端，與伴生的甲基化酶一起形成I、II、III三種限制修飾系統(tǒng)。其中基因操作中最常用的是II型系統(tǒng)，它們識別回文對稱序列，在序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3-羥基和5-磷酸基團(tuán)的DNA產(chǎn)物，需的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需SAM。甲基化酶(每一種限制性內(nèi)切酶都對應(yīng)一種甲基化酶)：甲基化酶

14、可在其識別位點(diǎn)內(nèi)引入甲基，用于保護(hù)DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。通過甲基化修飾還可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌吟N6位置上引入甲基。Dcm甲基化酶識別CCAGG或CCTGG，在第二個胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。連接酶：T4DNA連接酶可以催化DNA5，-磷酸和3-0H之間形成磷酸二酯鍵，用于DNA的粘性末端和平末端連接；E.coliDNA連接酶作用需NAD+的參與，常用于DNA的粘性末端連接和cDNA克?。籘4RNA連接酶可以催化ssDNA或RNA的5-磷酸與另一ssDNA或RNA的3-0H之間形成共價連接，可用于標(biāo)記DNA和RNA的3末端，單鏈DNA或RNA的連

15、接；TaqDNA連接酶：可在兩個寡核苷酸之間進(jìn)行連接反應(yīng)，同時必須與另一DNA鏈形成雜交體，相當(dāng)于連接雙鏈DNA中的缺口，需NA。可用與檢測等位基因的變化及在PCR擴(kuò)增中引入寡核苷酸，但不能替代T4DNA連接酶。DNA聚合酶(依賴于DNA的DNA聚合酶)：大腸桿菌DNA聚合酶I具有三種活性：5J3DNA聚合酶活性;5J3外切核酸酶活性；3J5外切核酸酶活性。利用其5J3外切核酸酶活性可用切口平移法標(biāo)記DNA；用于克隆cDNA中的第二鏈;對3-突出末端的DNA作末端標(biāo)記。用蛋白酶將大腸桿菌DNA聚合酶I裂解形成的KlenowDNA聚合酶具有聚合活性和35外切核酸酶活性，可補(bǔ)平有3凹端的DNA或抹

16、平3凸端，還可對DNA進(jìn)行末/11端標(biāo)記，在cDNA克隆中合成第二鏈。T4噬菌體DNA聚合酶與KlenowDNA聚合酶相似，只是外切核酸酶活性更強(qiáng)，在誘變反應(yīng)中很有用。T7噬菌體DNA聚合酶與T4DNA聚合酶活性類似，是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一種，可用于長模板的引物延伸。耐熱DNA聚合酶：如TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等，來自嗜高溫細(xì)菌，主要用于PCR反應(yīng)。T4多核苷酸激酶（PNK）：一種磷酸化酶，可將ATP的Y-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5末端。該酶主要用于對缺乏5-磷酸的DNA或合成接頭進(jìn)行磷酸化（消耗ATP），同時可對末端進(jìn)行標(biāo)記（先去磷

17、酸化ADPATP,再磷酸化ATPADP）。堿性磷酸酶（如小牛腸堿性磷酸酶，CIP）：該酶催化去除DNA或RNA的5，-磷酸，防止DNA片段的自身連接。用該酶后要進(jìn)行純化，避免殘留。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：源于小牛胸腺的一種不尋常DNA聚合酶，可不依賴于模板。在2價陽離子存在下，該酶催化dNTP加于DNA分子的3羥基端。若dNTP為T或C,陽離子首選C；若dNTP為A或G,陽離子首選。該酶可在cDNA或載體3末端加同聚尾，便于克??；也可用標(biāo)記的rNTP、ddNTP或ddNTP來標(biāo)記DNA片段的3末端。反轉(zhuǎn)錄酶即依賴于RNA的DNA聚合酶：有5，十3合成DNA活性，但是無3f5外切核酸酶活性，該酶主

18、要用來cDNA克隆中第一鏈的合成、測定mRNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、5突出DNA的補(bǔ)平和標(biāo)記、雙脫氧終止法測序、RT-PCR等。該酶有兩種來源：AMV（禽成髓細(xì)胞瘤病毒）反轉(zhuǎn)錄酶：具53合成DNA活性和RNaseH活性；Mo-MLV（鼠白血病病毒）反轉(zhuǎn)錄酶。依賴于DNA的RNA聚合酶（Sp6、T7和T4噬菌體RNA聚合酶）：該酶為轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識別DNA中各自特異的啟動子序列，無需引物。用于單鏈RNA探針；合成mRNA用于體外蛋白質(zhì)合成。核酸酶：Bal31核酸酶：主要活性為3外切核酸酶活性（Ca2+）,可從線性DNA兩條鏈的3端去除掉單核苷酸，達(dá)到兩頭縮短DNA的目的，用于缺失突變，構(gòu)建嵌套缺失

19、體；也可用來制作DNA限制酶切圖；確定DNA二級結(jié)構(gòu)和從單鏈RNA上去除核苷酸。S1核酸酶：可降解單鏈DNA或RNA,是一種單鏈核酸酶。產(chǎn)生帶5-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸雙鏈，可用于分析DNA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，去掉突出的單鏈尾以產(chǎn)生平末端；降解發(fā)夾結(jié)構(gòu)。綠豆核酸酶：與S1核酸酶相似，但更溫和。脫氧核糖核酸酶I：可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解dsDNA或ssDNA?？稍谇锌谄揭茦?biāo)記時在dsDNA上隨機(jī)產(chǎn)生切口；在閉環(huán)DNA上引入單切口，將分子截短；在DNA酶足跡法中分析蛋白：DNA復(fù)合物；除去RNA樣品中的DNA。核糖核酸酶A（RNaseA）:內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3端?？沙?/p>

20、去DNA:RNA中未雜交的RNA；可用來確定DNA或RNA中單堿基突變的位置；除去DNA樣品中的RNA。核糖核酸酶H（RNaseH）：可特異性水解與DNA雜交的RNA上的磷酸二酯鍵，不降解單鏈核酸、dsDNA或dsRNA，主要用于在cDNA克隆時合成第二鏈之前去除RNA；或除去mRNA與Poly（T）退火后的Poly（A）尾巴。（1DDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I：來自小牛胸腺，該酶通過瞬時破壞并再生磷酸二酯鍵，解除共價閉合環(huán)dsDNA中的超螺旋，對DNA的超螺線度不敏感，在EDTA下仍有活性。（12）其他酶類：尿嘧啶-DNA糖基化酶，可將含尿嘧啶的單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶水解出來，去除尿嘧啶堿基后的D

21、NA片段不能再作為DNA聚合酶合成DNA的模板；Cre重組酶：是噬菌體P1的I型拓?fù)涿福纱呋疍NA在兩個loxP位點(diǎn)之間發(fā)生特異性重組；蛋白酶K：可水解范圍廣泛的肽鍵，能有效降解內(nèi)源蛋白，快速水解細(xì)胞裂解物中的DNA酶和RNA酶，以利于完整DNA和RNA的分離；溶菌酶：水解細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的酶，常用于破碎細(xì)胞。8.T4DNA聚合酶有哪些作用？答：T4噬菌體DNA聚合酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，具有5f3DNA聚合酶活性和3*5外切核酸酶活/11f性，與KlenowDNA聚合酶活性相似，但其3外切酶活性更強(qiáng)。由于其53合成DNA和35降解DNA是一對方向相反的可逆反應(yīng)，在高濃度dNTP

22、存在時，反應(yīng)朝向合成方向進(jìn)行，可以補(bǔ)平3凹端，如果使用帶標(biāo)記的dNTP,則可對DNA進(jìn)行末端標(biāo)記；當(dāng)dNTP濃度合適時，又可切割突出的3末端，形成平末端；不添加dNTP時，由于其3外切酶活性，可以切割3端核苷酸，用來制造黏性末端。該酶在誘變反應(yīng)中更有用，可使誘變率提高1倍。作為載體，應(yīng)具備哪些特征？答：（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自我復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）；（2）有合適的選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因，理想的載體應(yīng)該有兩種選擇標(biāo)記基因；（3）具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（有多克隆位點(diǎn)）供外源DNA片段插入；（4）有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備；（5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。如何構(gòu)建穿梭載體、

23、表達(dá)載體和整合載體？答：穿梭載體是一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，這類載體主要是質(zhì)粒載體，并至少含有兩套復(fù)制單元和兩套選擇標(biāo)記，相當(dāng)于兩個載體的聯(lián)合。穿梭載體一般在大腸桿菌中保藏、擴(kuò)增，然后將其轉(zhuǎn)到目標(biāo)宿主中，在目標(biāo)宿主中所起的作用由其所攜帶的功能元件決定。表達(dá)載體首先具有克隆載體的基本骨架，除了復(fù)制起點(diǎn)、合適的克隆位點(diǎn)和標(biāo)記基因外，還有表達(dá)元件：（1）強(qiáng)啟動子，一個可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動子可使外源基因有效地轉(zhuǎn)錄；（2）在啟動子下游區(qū)和ATG上游區(qū)有一個好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD序列），促進(jìn)蛋白翻譯；（3）在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個

24、強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和mRNA的穩(wěn)定性。還可以加入與分離純化有關(guān)的序列如GST系統(tǒng)，或加入信號肽序列幫助目標(biāo)蛋白分泌到胞外。整合載體：涉及將某個基因或某些基因插入到染色體中去的載體稱為整合載體，按其作用方式不同可分為：目標(biāo)基因的插入或敲除以及構(gòu)建隨機(jī)突變體庫。基因插入/基因敲除：同源重組整合載體是最常用的整合載體，該載體一方面含有大腸桿菌克隆載體的骨架，更主要的是含有一段便于同源重組的重組DNA片段。也就是從染色體上待插入位點(diǎn)處取出一段DNA,將選擇標(biāo)記基因和多克隆位點(diǎn)插入到這個片段中間得到這一重組DNA片段。隨機(jī)插入突變載體：隨著功能基因組研究的發(fā)展，不斷需要一系列發(fā)生基因

25、突變的材料。隨機(jī)突變體庫是指標(biāo)記基因在載體的攜帶下通過DNA重組事件隨機(jī)插入基因組中而形成的突變體的集合。為了提高標(biāo)記基因插入到基因組中的頻率，一般都要借助轉(zhuǎn)座子來幫忙。通過哪些技術(shù)可以獲得某一插入位點(diǎn)基因側(cè)翼的信息？答：當(dāng)獲得一段DNA后，若要得到與其相鄰的未知DNA片段，可通過染色體步查來完成。染色體步查是指從生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發(fā)，逐步獲得或探知其相鄰的未知序列或與已知序列呈共線性的目的序列的核苷酸組成的方法和過程。在經(jīng)典的染色體步查方法中，主要是通過構(gòu)建基因文庫，采用一段分離自某一重組體一端的非重復(fù)DNA片段作為探針以鑒定含有相鄰序列的重組克隆。該方法相對比較繁瑣，適合

26、長片段步查，而基于PCR的染色體步查技術(shù)相對而言則比較簡便，適合于小片段步查。通過PCR技術(shù)進(jìn)行的染色體步查方法大致分為3類：反向PCR：首先用已知片段內(nèi)部沒有的限制性內(nèi)切酶切割模板DNA，再將酶切后的DNA片段連接成環(huán)狀分子，其中至少有一個環(huán)狀分子含有完整的已知片段，根據(jù)已知片段兩端的序列設(shè)計反向引物，可將鄰近的DNA片段擴(kuò)增出來。利用接頭的PCR：該方法第一步先將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶切割，然后將序列已知的接頭片段連接到酶切片段兩端，以提供PCR需要的另一端引物。根據(jù)已知序列設(shè)計的引物和根據(jù)接頭序列設(shè)計的引物，可以將已知序列側(cè)翼的未知序列擴(kuò)增出來；熱不對稱交錯PCR（TAIL-PCR）

27、：其基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計3個嵌套的特異性引物（specialprimer，簡稱sp1,sp2，sp3,約20bp）,用它們分別和1個具有低Tm值的/11 /11短的隨機(jī)簡并引物（AD,約14bp）相組合，以基因組DNA為模板，根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計不對稱的溫度循環(huán)，利用不同的退火溫度選擇性地擴(kuò)增目標(biāo)片段，通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物，所獲得的片段可以直接用做探針標(biāo)記和測序模板。通過哪些技術(shù)可以獲得啟動子或復(fù)制起始位點(diǎn)？答：含啟動子活性的DNA片段的分離大體上有三種方法：鳥槍法克?。簩NA隨機(jī)片段直接克隆到無啟動子的探針質(zhì)粒pKO1上，其報告基因?yàn)榇呋糠磻?yīng)的半乳糖

28、激酶結(jié)構(gòu)基因galK,重組體轉(zhuǎn)化到ga的E.coli,以半乳糖為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。凡是具有啟動子活性的插入片段都有可能啟動galK報告基因的表達(dá)，并使半乳糖在E.coli中發(fā)生糖酵解反應(yīng)，重組克隆分泌紅色素；非重組克隆呈乳白色。（2）酶保護(hù)法分離：根據(jù)RNA聚合酶與啟動子區(qū)域的特異性結(jié)合原理設(shè)計。將E.coli基因組文庫中的重組質(zhì)粒與RNA聚合酶在體外保溫片刻，然后選擇合適的限制性內(nèi)切酶切割，未與RNA聚合酶結(jié)合的同一重組質(zhì)粒作酶切對照。如果試驗(yàn)質(zhì)粒的酶切片段比對照質(zhì)粒減少，則表明被鈍化的酶切位點(diǎn)位于RNA聚合酶結(jié)合區(qū)域內(nèi)，即該區(qū)域存在啟動子結(jié)構(gòu)。將這個區(qū)域的DNA片段亞克隆在啟動

29、子探針質(zhì)粒上，測定其所含有的啟動子轉(zhuǎn)錄活性。（3）濾膜結(jié)合法分離：其原理是雙鏈DNA不能與硝酸纖維素薄膜有效結(jié)合，而DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物卻能在一定條件下結(jié)合在膜上。將待檢測的DNA片段與RNA聚合酶保溫，轉(zhuǎn)移保溫復(fù)合物至膜上，溫和漂洗薄膜，除去未結(jié)合RNA聚合酶的DNA片段，然后再用高鹽溶液將結(jié)合在薄膜上的DNA片段洗脫。一般來說，這種DNA片段在膜上的滯留程度與其同RNA聚合酶的親和性（即啟動子的強(qiáng)弱）成比例，然而這種強(qiáng)弱難以量化，仍需將其克隆在探針質(zhì)粒上進(jìn)行檢測。如何構(gòu)建大腸桿菌嚴(yán)謹(jǐn)控制表達(dá)系統(tǒng)？PET表達(dá)系統(tǒng)的原理答：Lac操縱子在無誘導(dǎo)物的情況下，負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI基因產(chǎn)物與啟動子下游

30、的操作基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。在誘導(dǎo)劑IPTG存在的情況下，與阻遏蛋白結(jié)合后，導(dǎo)致與操縱基因的結(jié)合能力降低而解離出來,lac操縱子的轉(zhuǎn)錄因此被激活。用tac啟動子構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為Tac表達(dá)系統(tǒng)。為了能使Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，一種能產(chǎn)生過量的lacI阻遏蛋白的lacI基因的突變體lac被應(yīng)用于表達(dá)系統(tǒng)。但在使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄，還需在表達(dá)載體中插入lac基因以保證有較多的lacI阻遏蛋白產(chǎn)生。人們想到用阻遏蛋白lacI的溫度敏感突變株lacI（ts）應(yīng)用于Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)。這些突變體基因插入表達(dá)載體或整合到染色體后，均能使lac

31、，tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，在較低溫度（30C）時抑制，在較高溫度（42C）時開放。可控性啟動子的溫度誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)在容積較?。?5L）的培養(yǎng)基中容易實(shí)現(xiàn)，但對于20L以上的發(fā)酵罐而言，長時間在42C下誘導(dǎo)既耗費(fèi)能源，誘導(dǎo)效果又不理想，因?yàn)閺?8C升溫至42C往往需要幾十分鐘。大規(guī)模發(fā)酵過程中添加IPTG誘導(dǎo)物成本也較高。解決方案如下:涉及到比啟動子的E.col工程菌的構(gòu)建可采用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng):將CI阻遏蛋白合成置于已:；啟動子控制之下，并克隆在一個低拷貝質(zhì)粒上，從而保證CI阻遏蛋白表達(dá)不至于過量；第二重組質(zhì)粒則含有比啟動子控制的外源基因。當(dāng)培養(yǎng)基中缺少色氨酸時，比；啟動子打開，

32、CI阻遏蛋白合成，由比啟動子介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉；相反，當(dāng)色氨酸大量存在時，巴：；啟動子關(guān)閉，CI阻遏蛋白不再合成，比啟動子開放并激活外源基因表達(dá)。從整體上看，外源基因雖然處于比啟動子控制之下，但卻可用色氨酸取代溫度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。如何實(shí)現(xiàn)將某一基因整合入染色體的特定位點(diǎn)，又如何檢測該基因是否整合成功？答：整合方法：涉及將某個基因或某些基因插入到染色體中去的載體稱為整合載體，按其作用方式不同可分為：目標(biāo)基因的插入或敲除以及構(gòu)建隨機(jī)突變體庫?；虿迦?基因敲除：同源重組整合載體是最常用的整合載體，該載體一方面含有大腸桿菌克隆載體的骨架，更主要的是含有一段便于同源重組的重組DNA片段。也就是從染色

33、體上待插入位點(diǎn)處取出一段DNA,將選擇標(biāo)記基因和多克隆位點(diǎn)插入到這個片段中間得到這一重組DNA片段。隨機(jī)插入突變載體：隨著功能基因組研究的發(fā)展，不斷需要一系列發(fā)生基因突變的材料。隨機(jī)突變體庫是指標(biāo)記基因在載體的攜帶下通過DNA重組事件隨機(jī)插入基因組中而形成的突變體的集合。為了提高標(biāo)記基因插入到基因組中的頻率，一般都要借助轉(zhuǎn)座子來幫忙?；蚨c(diǎn)整合技術(shù)又稱為基因打靶是指構(gòu)建含有同源序列的片段的整合載體，通過各種轉(zhuǎn)化方法，使外源序列與靶序列之間發(fā)生同源重組，從而將靶序列定點(diǎn)破壞，通過一系列篩選手段，最終得到定向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。檢測方法：根據(jù)重組載體的標(biāo)志進(jìn)行鑒定：利用重組載體中的標(biāo)記基因可以篩選獲得陽

34、性重組子。如最常見標(biāo)志耐藥性標(biāo)志，若外源基因插入在抗性基因外部，在含有抗生素的培養(yǎng)基中，只有攜帶相應(yīng)耐藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖，而未能接受載體DNA的細(xì)胞則全部被篩除掉。通過插入失活也可以進(jìn)行篩選，質(zhì)粒上具有兩種抗性標(biāo)記基因，當(dāng)外源基因插入其中一個時，就會導(dǎo)致其失活，從而只能對另一種抗生素具有抗性，這樣就以對抗生素是雙抗還是單抗來篩選。還可以利用a-互補(bǔ)原理來篩選，以IPTG誘導(dǎo)X-gal底物顯色選擇，重組菌為白色菌落，非重組顯藍(lán)色。(2)DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析：目的序列插入載體會使DNA限制性酶圖譜發(fā)生變化。利用這種變化可以鑒定插入序列。通常利用重組時的酶切割重組子DNA，若獲得與

35、目的基因一致的片段即證明重組子中含有插入序列。利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定含有目的基因的陽性克隆。常用的雜交方法包括菌落原位雜交、Southern雜交。菌落原位雜交直接將轉(zhuǎn)化后生長的菌落復(fù)印到硝酸纖維素膜上，經(jīng)堿裂解后，將菌落釋放的DNA原位吸附在沒上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的基因的菌落DNA上而不被洗脫，待顯色后就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。PCR法：如果已知目的基因的長度和兩端的序列，設(shè)計合成一對引物，以轉(zhuǎn)化生長的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，挑選出PCR產(chǎn)物，與預(yù)期長度相符的克隆，可能就是含有目的序列的重組子。免疫學(xué)

36、方法：通過特定的標(biāo)記抗體與基因表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)指示含有目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因而要求目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后能夠表達(dá)。利用標(biāo)記抗體的酶可催化特定的底物反應(yīng)而呈現(xiàn)顏色變化，可以指示含有目的基因的克隆位置。核酸序列測定：直接測序可以得知序列信息是否發(fā)生變化。綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記：通過檢測綠色熒光蛋白來鑒定目的基因是否已經(jīng)插入。凝膠電泳15.如何制備RNA探針、DNA探針？答：將需要制備的目的基因的一小段寡核苷酸序列，插入到含有T7或SP6啟動子的載體上，并處于啟動子下游；再利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割得到線性DNA分子，然后加入RNA聚合酶、NTP和標(biāo)記物，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到標(biāo)記的小分子RNA探針。這種

37、方法可以快速制備各種標(biāo)記(同位素、非放射性標(biāo)記均可)的小于lOOnt的小分子RNA探針，適用于Northern和原位雜交等。注意事項(xiàng)：(1)制備單鏈探針時的正應(yīng)注意插入方向確性；(2)外源基因插入后應(yīng)線性化。常見DNA探針制備方法則有缺口平移，隨機(jī)引物法，單鏈探針，末端標(biāo)記(Klenowfragment、T4DNA聚合酶標(biāo)記3端、激酶標(biāo)記5端、末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記3端)等。影響基因表達(dá)的因素有哪些？答：影響因素有：啟動子強(qiáng)度；轉(zhuǎn)錄終止子；誘導(dǎo)條件；培養(yǎng)條件；質(zhì)粒拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)錄起始序列；密碼子偏愛性;mRNA結(jié)構(gòu)(序列穩(wěn)定性和半衰期)；寄主生理?xiàng)l件(蛋白酶活性)如何實(shí)現(xiàn)某一基因在異源宿主中的表達(dá)？答：首

38、先要考慮的是表達(dá)元件的組裝：（1）選擇合適的復(fù)制起點(diǎn)，翻譯起始序列不同會影響起始效率；（2）報告基因；（3）啟動子（強(qiáng)度，可控性，宿主專一性）；（4）SD序列：SD序列與起始密碼子之間的精確定位；（5）密碼子：宿主對密碼子的偏愛性；（6）較強(qiáng)的終止子；（7）質(zhì)粒拷貝數(shù)：高拷貝質(zhì)粒數(shù)以保證mRNA的產(chǎn)量，進(jìn)而提高合成速度。還要考慮異源蛋白在宿主中的定位，即可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，或通過分泌方式運(yùn)送到胞外。分別針對其不同特點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)序列時應(yīng)做相應(yīng)的修飾。構(gòu)建基因文庫的基本策略：答：基因組DNA文庫的構(gòu)建程序包含5個部分：載體的制備；高純度大分子量基因組DNA的提取；基因組DN

39、A的部分酶切與脈沖電泳分級分離；載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；重組克隆的挑取和保存。構(gòu)建噬菌體文庫如P1等的程序稍有不同，連接產(chǎn)物不用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化宿主，而是采用包裝蛋白進(jìn)行包裝并侵染宿主?；蚪MDNA文庫的載體制備：載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點(diǎn)，一是純度高；二是去磷酸化好。高質(zhì)量大分子量基因組DNA的提取和部分酶切：構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對DNA質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的35倍。實(shí)踐表明，提取的基因組DNA分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。III文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染：一般在構(gòu)建大片

40、段基因組DNA文庫時，大量連接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白，同時，研究表明對連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。另外，對于電轉(zhuǎn)化而言，選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對不同插入片段的DNA的轉(zhuǎn)化效率也有所不同。W.文庫的質(zhì)量檢測：在文庫的質(zhì)量檢測中，除了克隆子數(shù)目是可以確定的，其它值都是估算的。文庫的平均插入片段長度是通過PFGE電泳檢測一定數(shù)目的重組子的插入片段大小所得平均值?；蚪M覆蓋倍數(shù)的計算方法一般包括兩個過程，一是計算法，基因組覆蓋倍數(shù)二平均插入片段長度x克隆數(shù)/基因組DNA的長度（一般

41、是約數(shù)）；另一種算法是結(jié)合基因組覆蓋度的檢測來進(jìn)行的?；蚪M覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時是通過選擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫。由于所使用的每個探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫中對該基因位點(diǎn)的覆蓋倍數(shù)，因此，基因組覆蓋倍數(shù)又等于所有探針篩到的陽性克隆的總個數(shù)使用的總探針數(shù)的比值。（質(zhì)量優(yōu)良的基因文庫的代表性與基因文庫的大小，即克隆數(shù)多少呈正相關(guān)）。V.基因文庫的擴(kuò)增、分裝及保存。cDNA文庫的構(gòu)建策略：細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；第一鏈cDNA合成；第二鏈cDNA合成；雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。試述基因芯片、蛋白質(zhì)芯片的工作原理：答

42、：基因芯片又稱DNA芯片或DNA陣列，是將大量DNA探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，并與標(biāo)記的樣品分子雜交，通過自動化儀器檢測雜交信號的強(qiáng)度來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進(jìn)而得知樣品中mRNA的表達(dá)量，也可進(jìn)行基因突變體的檢測和基因序列的測定，為進(jìn)一步了解基因間的相互關(guān)系及基因克隆提供有用的工具。蛋白質(zhì)芯片是利用抗體與抗原結(jié)合的特異性即免疫反應(yīng)來構(gòu)建的，首先選擇一種能夠牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）的固相載體，在上面按預(yù)先設(shè)計的方式固定大量蛋白質(zhì)（抗原或抗體），形成蛋白質(zhì)的微陣列，即蛋白質(zhì)芯片，然后加入與之特異性結(jié)合的帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體），通過對標(biāo)記物的檢測來實(shí)

43、現(xiàn)抗原抗體的檢測，即蛋白質(zhì)檢測。/11試述酵母雙雜交系統(tǒng)、單雜交系統(tǒng)：答：酵母雙雜交系統(tǒng)是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，往往由兩個或兩個以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時不能激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g距離上較為接近時，才能形成有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這個特性，將編碼3D的基因與已知蛋白X的基因構(gòu)建在同一個表達(dá)載體上，形成融合蛋白BD-X，并以含有BD-X融合蛋白和報告基因的細(xì)胞為構(gòu)建文庫的受體菌；而將編碼AD的基因

44、和目的蛋白Y的基因構(gòu)建融合基因文庫，產(chǎn)生融合蛋白AD-Y。同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，表達(dá)兩者的融合蛋白。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活含有BD結(jié)合位點(diǎn)的啟動子下游報告基因的表達(dá)，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用。酵母單雜交技術(shù)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報道基因表達(dá)的原理來克隆編碼目的轉(zhuǎn)錄因子的基因。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，研究表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)；而激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)

45、錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此，可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白，只要它能與我們想了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：將文庫蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒；含有目的基因和下游報告基因的報告質(zhì)粒。在實(shí)驗(yàn)中，首先將報告質(zhì)粒整合入酵母基因組，產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報告株；再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報告株；若存在文庫蛋白與目的基因的相互作用，可通過對報告基因的表達(dá)將文庫蛋白的基

46、因篩選出來。簡述PCR在基因操作中的應(yīng)用：答：(1擴(kuò)增未知DNA片段：當(dāng)獲得一段DNA后，若要得到與其相鄰的未知DNA片段，可通過染色體步查來完成。通過PCR技術(shù)進(jìn)行的染色體步查方法大致分為3類：反向PCR；利用接頭的PCR:熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)。反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板所進(jìn)行的PCR反應(yīng)，可用于測定基因表達(dá)的強(qiáng)度，還可用于鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變，呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性，克隆mRNA的5和3末端序列，以及從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫。該技術(shù)已演變成特殊的PCR技術(shù)口：DNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)；差異顯示PCR(DD-PC

47、R)。通過PCR擴(kuò)增在擴(kuò)增DNA產(chǎn)物末端引入限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物的5末端區(qū)域內(nèi)部常被設(shè)計相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。在許多情況下，兩個引物的內(nèi)部被設(shè)計不同的酶切位點(diǎn)。通常擴(kuò)增產(chǎn)生的靶片斷的雙末端被引入新的酶切位點(diǎn)經(jīng)酶切消化后的擴(kuò)增片斷能定向克隆至相應(yīng)的質(zhì)粒載體上。多重PCR：在一個反應(yīng)體系中使用一對以上引物的PCR稱為多重PCR。多重PCR可用于等位基因的鑒定，若在一個品種中多個相似基因共存，可設(shè)計一系列引物對其進(jìn)行鑒定，對每種類型的基因設(shè)計特異性的PCR引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物的大小彼此不同，從而可以通過擴(kuò)增產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量來判斷樣品中所含的基因類型。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DN

48、A(RAPD)：用長度為10個或11個堿基的單一固定序列引物可擴(kuò)增出隨機(jī)大小的DNA片段，產(chǎn)生DNA片段的多態(tài)性，也就是DNA指紋。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)：擴(kuò)增長度片段多態(tài)性分析是針對基因組DNA的限制性酶切片段進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增而建立DNA指紋的技術(shù)。首先將基因組DNA以兩種限制性內(nèi)切酶完全切割，之后再將合成的并與這兩個限制酶產(chǎn)生的末端相對應(yīng)的接頭與酶切DNA片段的兩端連接。然后以含有接頭序列和酶切位點(diǎn)序列的引物對連接產(chǎn)物作PCR擴(kuò)增。最后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，從而產(chǎn)生DNA指紋。熒光實(shí)時定量PCR：利用特定設(shè)計的PCR儀器檢測PCR擴(kuò)增過程中標(biāo)記的熒光信號的

49、累積來實(shí)時監(jiān)測整個/11PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析?？寺≡谠溯d體的DNA片段的快速鑒定。已轉(zhuǎn)化的重組載體的細(xì)菌細(xì)胞或者噬菌體顆粒可通過直接從培養(yǎng)皿上挑取菌落或噬菌斑獲得，然后直接加入到PCR混合液中，這時PCR混合液中除了未加熱穩(wěn)定DNA聚合酶外的所有試劑，其中引物與所要鑒定的已克隆DNA片斷的側(cè)翼序列互補(bǔ)。將PCR反應(yīng)混合液加熱煮沸幾分鐘，使DNA模板從細(xì)菌細(xì)胞或者噬菌體顆粒中釋出，并使核酸酶和蛋白酶失活。然后，加入一種熱穩(wěn)定DNA聚合酶于反應(yīng)液中，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR的約30個循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，DNA序列予以確證以及southern

50、雜交和酶切圖譜分析鑒定等。（此外，還有不對稱PCR、標(biāo)記PCR、加端PCR、錨定PCR、核酸的基礎(chǔ)研究、序列分析、檢測基因表達(dá)、從cDNA庫中放大特定序列、研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段、進(jìn)化分析、醫(yī)學(xué)應(yīng)用診斷單基因遺傳疾病、分析生物學(xué)證據(jù)、性別控制、轉(zhuǎn)基因檢測等等應(yīng)用。）引物設(shè)計應(yīng)遵循哪些原則？答：引物長度應(yīng)為1530個核苷酸，Tm接近72C較佳。Tm=（G+C）*4+（A+T）*2引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。引物中堿基的分布應(yīng)當(dāng)是隨機(jī)的，避免出現(xiàn)一連串的單一堿基或產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)。G+C堿基的含量在4060%之間。兩個引物在3端均必須與模板互補(bǔ)，5端可以不互補(bǔ)。引物自身連續(xù)

51、互補(bǔ)堿基小于4個。引物之間連續(xù)互補(bǔ)堿基亦應(yīng)小于4個。引物5端可以修飾。引物3端不可以修飾。引物3端要避開密碼子的第3位。若獲得某一有價值的蛋白質(zhì)，如何對其進(jìn)行深入研究？答：首先進(jìn)行常規(guī)理化性質(zhì)檢測，分析其分子量大小測定方法：滲透壓、沉降平衡、凝膠過濾層析、激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜）；等電點(diǎn)測定（方法：溶解度法、等電聚焦）；末端氨基酸殘基測定（N端和C端氨基酸測定方法分別有二硝基氟苯法、丹磺酰氯法、異硫氰酸苯酯法和肼解法、羧肽酶法）；蛋白質(zhì)分子中的糖鏈（血球凝集反應(yīng)、糖蛋白電泳、糖組分色譜分析）。然后再測定其一級結(jié)構(gòu)（方法有Edman化學(xué)降解法、酶降解法、質(zhì)譜法、根據(jù)核苷酸序列推定法；將得到的該蛋白質(zhì)序列提交蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫與其他已知的序列進(jìn)行比對，確定是否有同源蛋白質(zhì)存在，根據(jù)其同源結(jié)構(gòu)預(yù)測該蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。若無同源蛋白質(zhì)發(fā)表，也可利用X射線結(jié)晶、冷凍電鏡術(shù)、核磁共振技術(shù)確定其構(gòu)象。在得知其預(yù)測結(jié)構(gòu)后，可利用定點(diǎn)突變技術(shù)來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。有哪些技術(shù)可以檢測轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的差異？答：轉(zhuǎn)錄水平：