免疫組化照片密度定量分析

1、免疫組化照片密度定量分析=轉(zhuǎn)載鏈接應用實例一免疫組化照片密度定量分析。估計這是大家用得最多的，所以先講這個了。免疫組化技術現(xiàn)在是很成熟的方法，但是對免疫組化照片的分析并沒有一個權威的說法?，F(xiàn)在可以查到無數(shù)篇應用圖像分析來分析免疫組化的文獻，但幾乎沒有哪一篇能詳細地敘述分析的過程與方法。首先，免疫組化的樣品應該是用DAB對免疫組化產(chǎn)物染色，同時用蘇木對細胞核進行復染。鏡下觀察樣品，細胞核被染上了藍色，胞漿間有黃色（強陽性的地方會呈現(xiàn)棕黃色）。居然經(jīng)常能看到其他顏色的免疫組化照片，這肯定是樣品制作過程中有了差錯。用肉眼觀察免疫組化切片的結(jié)果只能是定性的，不準確的。使用圖像分析軟件定量地（至少是半定

2、量）對照片測量出一個數(shù)值來自然比用肉眼看更準確。切片上陽性反應物量是由圖片上黃色染色的深淺與面積一起表現(xiàn)的。所以最終要測量的就是圖片上黃色部分的累積光密度（），這是個沒有單位的相對數(shù)值。就是把圖片上每個黃色的象素點的強度值全部累加起來得到的值。除以一個適當?shù)拿娣e，就是一個平均光密度。這個面積可以就是照片的面積,也可以是照片上一個組織區(qū)域的面積，或者是有黃色的區(qū)域的面積。必須根據(jù)切片的實際情況來適當選擇。對于細胞核的免疫組化切片，在細胞核上，由于有藍色復染，所以需要另一種分析方法。將另作講解。仔.*!星*這張照片曝光稍大。但仍能表現(xiàn)出免疫組化的黃色染色與細胞核的藍染。在拍攝照片時，需要注意的地方

3、是：1所有的照片必須以同樣的顯微鏡環(huán)境與拍攝條件來拍攝。在拍攝照片時，要保持顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定，用同樣的曝光時間拍攝照片。在更換視野或切片時，除了對焦距這個操作外，其他所有的操作都不能有變化。強陽性的樣品就是暗的黃的，弱陽性的樣品則亮一些，陰性樣品就是一片白。這樣才能測量出正確的密度值。2曝光的選擇：試拍攝一張空照片，看一下白色背景的亮度，應該在230附近。過低過高都不好。注意相機白平衡：如果使用的是專業(yè)相機，會有校正白平衡的功能，此時應對空視野進行白平衡校正。如果是普通的數(shù)碼相機，要關閉自動白平衡功能。或者選擇陽光模式。避免拍攝的照片因為色偏而偏藍或偏黃。4.很多顯微鏡都是同時有熒光附件的

4、，在拍攝熒光照片時要加上濾光片，注意有時候這些濾光片會忘了移開，結(jié)果拍攝的照片就會嚴重偏色。正確地拍攝照片是圖像分析的基礎，以后的各項應用實例中往往都會先介紹如何拍攝照片。圖像分析方法：1.校正圖片光密度照片，第黑色為0，白色為25一步就是要校正光密度。照片上黃色點的亮度數(shù)值是灰度，5這與.免疫組化強度是相反的。深色深的點，數(shù)值應該更大才對。在理論上，圖片上的灰度與樣品阻擋光線的物質(zhì)光密度是一個指數(shù)關系，對于白色的色點，對應樣品透光率為100，%光密度為零。對于黑色的點，對應樣品透光率為0，光密度為無窮大，但實際上把這個光密度值定為2.校0.正光密度值就是把程序的光密度值設置成這樣的坐標。的窗

5、口里點然后選擇d片上最白的地方，然后看程序窗口下方的狀態(tài)欄，會有顯示該點的三色各自的灰度值，在其顯示的數(shù)值中間選擇一個差不多的整數(shù)，比如23，0或，作為背景扣除值。操作方法是：點按紐，在彈出的小窗口中的中把默認的改為或返回就可以了。最后在窗口右上方點一下把這個校正作為系統(tǒng)光密度值應用于所有圖片。這個設定被默認地命名為。光密度校正的窗口不要關閉,可以移到邊上放著隨時檢查。有時候新照片未必會應用上，要重新調(diào)出剛才設定.選色。在中使用模式，選擇然后點。的選擇范圍是可以根據(jù)圖片情況作微調(diào)的。保存這個選色設置。一般放在圖片的保存文件夾里。默認的保存文件是。一個是。要選擇。另外默認的選擇都是要測量的。對的

6、過濾值，默認為0實際上還可以大點，設置到甚至也行，可以把那些小的雜質(zhì)點去掉。另一個是4.保存分析環(huán)境。在窗口中點。保存環(huán)境設置文件。5測量用工具畫出測量區(qū)域。這里很關鍵的一點就是如何畫這個測量區(qū)域。最普通的情況下，要測量整張照片的光密度，就不必畫這個測量區(qū)域了。此時會測量照片上全部被選中的黃色的光密度總和（），面積就是照片的面積。如果你拍攝的照片上，有個角正處于切片邊緣，沒有細胞，這就需要把這個角上的空白面積給扣掉了，此時畫的“測量區(qū)域”就應該沿著樣品的邊緣來畫。另一種情況是，要測量一個癌巢里的蛋白表達，邊上正常組織上的表達不算。這時候就要沿著這個癌巢的邊界畫這個“測量區(qū)域”。點按紐。完事。測

7、量數(shù)據(jù)在窗口中，讀取數(shù)值,作為這張照片的累積光密度值。其他的數(shù)值都是沒用的。如果你用工具畫了一個“測量區(qū)域”，那點時，程序會只測量“測量區(qū)域”內(nèi)的。外面的不管。在測量數(shù)據(jù)中顯示的是黃色部分的面積。在很多情況下，這個面積值意義不大。測量面積。通常我們需要測量的是一個平均光密度（）而不是積分光密度o上一步已經(jīng)測量了，現(xiàn)在就要測量了，再說一遍，上一步的測量數(shù)據(jù)里的在通常情況下并不是正確的。如果測量的是整張照片，就是照片的面積。如果用畫了“測量區(qū)域”，就是這個測量區(qū)域的面積。此時只要在窗口中點，然后就能在測量數(shù)據(jù)窗口中看到測量面積了。此時還能看到另一個值，這個值是不能用的，它包括了藍色細胞核的光密度。

8、數(shù)值處理：對每一張照片，要測量一個，如果選擇了測量區(qū)域，還要測量一個。這張照片的測量值一般是平均光密度，它反映了這張照片上免疫反應物的表達強度。在測量整張照片的時候，可以只測量，在這種情況下，所有照片的面積都是相等的。與都是個相對值，所以是沒有單位的。其實值本身就是個比例值。這個詞在分光光度計上常用，意思是通常我們有兩組實驗對象，實驗組與對照組，每組有十來個樣品，各拍攝幾張照片。每個樣品拍攝的幾張照片測量的再作一次平均，作為這個樣品的一個實驗組的幾個樣品測量值可以計算其平均值與標準差，或者直接用檢驗去統(tǒng)計兩組的統(tǒng)計學差異。把一張照片的測量值當作一個數(shù)據(jù)也是可以的。再次強調(diào)，一張照片只測量一個值

9、或值，作為這張照片的測量數(shù)據(jù)。窗口中的其他統(tǒng)計數(shù)值不必管它。8.批量測量照片：測量一組照片時，首先用一張比較典型的照片按上面步驟測量。然后在測量其他照片時，必須用這些測量條件來測量。因為已經(jīng)保存了背景校正、選色文件與測量環(huán)境文件，所以在測量時要直接調(diào)用這些設置文件。8.1把第一張照片最小化，不要關閉。8.打2開第二張照片，或者一次打開全部照片，激活一張。8.3檢查光密度校正窗口，確認應用了光密度校正。在中，調(diào)出環(huán)境設置文件。點調(diào)出窗口。確認處于及模式下。再調(diào)出選色文件。需要時用畫測量區(qū)域。點測量，記錄數(shù)據(jù)（點中的），再點測量面積，再記錄數(shù)據(jù)（還是點里的c注意，這是兩次向輸送數(shù)據(jù)，所以事先要在中選擇,否則后面的數(shù)據(jù)會沖掉前面的）。8.關8閉圖片，再測量下一張。上面的測量步驟有個系統(tǒng)誤差。在測量的時候是直接測量彩色照片的，雖然對測量結(jié)果影響不大，如果希望測量得細致一點，就需要增加一個將彩色圖片轉(zhuǎn)換成黑白圖片的步驟。方法是：在選擇完顏色后（就是上面的之后），在窗口里的下面選擇可以看見圖片上除了黃色外，其他地方都變成白色了。然后點復制這張效果圖片。轉(zhuǎn)換這張圖