放射免疫分析

1、關于放射免疫分析第一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 放射免疫分析 一、基本原理：放射免疫分析（radio immunoassay，RIA）是體外放射分析技術中建立最早、應用最廣的一類技術，其基本原理為競爭性抑制。即：放射性標記抗原和非標記抗原（包括標準抗原或待測抗原）共同與特異性抗體發(fā)生可逆性結合，如圖8-1。這種競爭可用以下反應式來表達： 第二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 Ag + Ab AgAb+Ag*Ag*Ab 式中Ag *代表標記抗原，Ag代表非標記抗原，Ab代表特異性抗體，Ag * Ab代表標記抗原抗體復合物，AgAb代表非標記抗原抗體復合物。 第三張

2、，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 當反應體系中同時存在Ag、Ag *和Ab，而Ag *的量一定、Ab的量限定（分子數少于抗原）時，隨著Ag的增加，Ag * Ab的量相應減少，即與Ag（包括標準抗原或待測抗原）的量呈負相關競爭性抑制。當反應達到平衡后，將反應體系中的標記抗原抗體復合物與游離的標記抗原分離，測定其放射性。以標準抗原的濃度為橫坐標，以標記抗原抗體復合物的結合率（B/T、B/F、B/B0）為縱坐標，繪制劑量效應曲線（calibration curve），也稱標準曲線。第四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月試劑盒組成：（以T4測定為例）1、Ag (系列標準品)，濃度分別為

3、： 0、20、40、80、160、320ng/ml2、Ag*，125I-T4（紅色，作為示蹤劑）3、Ab， 抗T4抗體（作為結合劑）4、分離劑（免疫分離劑，結合反應達到平衡后將結合部分與游離部分分開）第五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 0 20 40 80 160 320 待1 待2加樣：1、Ag（系列標準品及待測樣品）50ul/每管2、Ag* 200ul/每管3、Ab 100ul/每管混勻，37 45分鐘，加分離劑離心，測定結合部分放射性。第六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月放射免疫分析的幾種標準曲線圖： 第八張，PPT共七

4、十四頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原抗體的結合反應遵循質量作用定律，即： 當反應達到平衡時，k1AgAb=k2AgAb。設KA為平衡結合常數，也稱親和常數，則有： 第九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 k1和k2分別代表結合速度常數和解離速度常數，Ag、Ab、AgAb分別代表游離抗原、游離抗體和抗原抗體復合物的濃度。假設Ab0和Ag0分別代表抗原、抗體的初始濃度，B和F分別代表反應平衡時結合和游離抗原的%，（以分數表示，B+F=1），可以推導出B的函數式， 由上式可看出是以B為函數的一元二次方程。對每一特定的RIA系統(tǒng)， Ab0和KA是固定的，*Ag0也是固定的，所以B在直角坐標上隨非標

5、記 Ag0呈雙曲線走向。第十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、基本試劑 （一）、抗體（antibody）(1)、抗體的制備：抗體是體外放射分析中應用最廣的結合劑，是用純化的免疫原免疫動物制備而得，免疫的成敗在于免疫原和動物種類以及注射途徑、佐劑的使用、注射劑量和時間等。 第十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 分子量超過5000的蛋白多肽物質具有較好的免疫原性，容易刺激高活度的抗體形成。分子量小于5000的肽類物質免疫原性低，需要與載體蛋白結合方能引起明顯的抗體形成。應該指出，動物對抗原的免疫反應個體差異很大，當一批動物用同樣的免疫原和免疫程序進行免疫時，往往只有部分動物

6、產生滿意的反應。第十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）抗血清（antiserum）的質量鑒定： 評價結合劑的主要指標有滴度、特異性和親和力。 1）滴度測定： 測定方法是將抗血清稀釋成不同濃度，分別加入一定量的標記抗原，在適當的反應條件下達到平衡后，分離B與F，計算不同稀釋度的抗血清與標記抗原的結合百分率，以結合百分率為縱坐標，以抗血清稀釋度為橫坐標，繪制抗血清稀釋曲線（如圖）。 第十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 選擇結合率為50%時所對應的稀釋度，作為該結合劑的稀釋度，該稀釋度即為滴度?？贵w滴度越高表明抗體的質量越好。 第十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022

7、年6月2）特異性測定：抗血清的特異性是指抗體與待測物以外的結構類似物結合的程度（又稱交叉反應率）。 交叉反應百分率 =Y50/Z50100% 其中Y50為被測物結合率50%時的濃度值；Z50為結構類似物結合率50%時的濃度值。干擾輕者特異性高。 第十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3）親和力和親和常數測定：親和力表示特定的抗原、抗體之間的結合能力，常用親和常數KA來表示。KA越大，表示抗原、抗體之間結合能力越強，B/F值大，方法的靈敏度高。 隨著單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）技術的發(fā)展，提高了現代體外分

8、析技術的特異性和親和力。 第十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、放射性標記物 放射性標記物是體外放射分析的測量依據，常用的標記核素有125I和3H。 對標記物的質量要求包括： （1）比活度（specific activity）：體外放射分析法的定量范圍一般在10-9-10-12mol水平，標記物的用量應等于或小于被測物的最小量，以得到較好的靈敏度。高比活度的標記物是確保分析方法靈敏度的前提。 第十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）放化純度（radiochemical purity）：一般要求標記物的放化純度在95%以上，若放射性雜質過多，標準曲線的斜率降低，將

9、會影響測定的靈敏度。（3）免疫活性（immune activity）：標記物在標記和儲存等過程中會造成損傷，使標記抗原的免疫活性下降，與抗體發(fā)生反應的能力減弱，甚至喪失，因此抗原活性的檢測十分重要。要求標記抗原與待測抗原具有相同的免疫活性。第十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）穩(wěn)定性（stability）： 穩(wěn)定性是指標記抗原在合理儲存的條件下，保持其全部性能不變的程度。許多因素可影響其性能的穩(wěn)定性，如標記方法、標記位置、置換水平、理化環(huán)境等都可使放射性核素從標記抗原的分子上脫落下來，或造成標記分子聚合或解離，使放化純度明顯下降。當標記方法合理，保存條件完善時，貨架期可達1-3

10、月。 第二十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）、標準品（calibration standard） 標準品是樣品定量的基礎，它的質和量的變化會直接影響樣品的測定值。 對標準品的要求包括：（1）標準品與待測物質應屬同一物質；（2）在與結合劑發(fā)生反應時，應與待測配體有相等的活性和親和力；（3）高度純化，不含影響分析的雜質；（4）標準品的定量一定要準確。第二十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四、分離技術 在放免分析中，當抗原、抗體反應達到平衡后，必須將B與F分離，分別測定其放射性。理想的分離技術應兼?zhèn)湟韵聨c：（1）將B與F盡可能完全分離，并且不改變最初的平衡狀態(tài)；（2）B

11、與F的分離不易受血漿或血清等外界因素的干擾；（3）分離試劑廉價易得，操作簡便、分離迅速、重復性好。幾種常用的分離技術介紹如下：（一）沉淀法（precipitation method） 也稱PEG法。溶解于水中的蛋白質，其分子周圍有水化層，以此保持蛋白質在水中的穩(wěn)定性，蛋白質分子吸水能力的大小取決于蛋白質分子電荷的多少。 第二十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 在一般RIA中，反應體系PH值多為中性附近，接近蛋白質的等電點，球蛋白所帶的電荷很少，形成水化層的能力較弱，當加入適當濃度的聚乙二醇或堿金屬中性鹽如硫酸胺等奪取其周圍的水分子，使它失去水化層，從而將抗體球蛋白（B）沉淀下來，與

12、游離部分的抗原分離。這種分離方法的優(yōu)點是操作簡便，分離迅速，價格低廉，但是，這種方法易受環(huán)境溫度（溫度高于30時沉淀物容易復溶） 、pH值、離子強度和蛋白質含量(最終濃度達250mg/ml以上 )及分子量(蛋白質分子量越大，用以沉淀的PEG濃度越小)的影響，并且有些抗原也可能被同時沉淀下來，所以，非特異性結合高。 第二十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）雙抗體法（double antibody method） 在RIA中，當抗原、抗體反應達到平衡后，由于抗原抗體復合物的濃度很低，而且處于可溶性狀態(tài)，不能直接通過離心的方法加以分離。于反應體系中加入第二抗體，形成抗原-第一抗體-第

13、二抗體復合物，通過離心將B與F分離開來。雙抗體法為一種特異性的分離方法，非特異性結合低，但主要缺點是分離時間長，第二抗體用量多等。第二十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月AgAb1Ab2 Ag Ab1 Ab1 Ab2Ag Ab1 Ab2第二十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）雙抗體-PEG法（double antibody-PEG method） 這種方法是目前被廣泛采用的一種方法，它兼顧了雙抗體法和PEG法各自的優(yōu)點，克服了雙抗法分離時間長和沉淀法非特異性結合高的缺點，并且使第二抗體和PEG的用量大為減少，在常溫加入

14、分離劑后，無需溫育，直接離心，可獲得滿意的結果。（四）吸附分離法（adsorptive separation method） 應用經過特殊處理的吸附劑，將游離的小分子抗原或半抗原吸附，經過離心，隨著吸附劑的沉淀，將F沉淀下來，而抗原-抗體復合物分子大，不被吸附，仍保留在溶液中，從而將B與F分離開。常用的吸附劑有葡聚糖包被的活性炭（DCC），離子交換樹脂等。 第二十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）固相分離法 這種分離法是將抗原或抗體通過特殊技術聯結在固相載體上，免疫反應在固相載體上完成，達到平衡后形成固相的抗原-抗體復合物，可與游離部分分離。固相分離技術的方法較多，比如，試管固

15、相法：將抗體IgG直接包被于試管底部，使用時將非標記抗原和標記抗原加入試管，抗原與包被在管底的抗體結合達到平衡後，棄去上清（F），洗滌后測定反應管（B）的放射性即可。固相分離技術的主要優(yōu)點是操作簡便、迅速，分離效果好，非特異性結合低，是一種比較有前途的分離方法。 第二十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（六）磁化分離技術（magnetizing separation technique） 磁化分離法是將磁化材料引入RIA體系，當反應達到平衡后，借助磁力將B與F分離，從而省去了離心的步驟。（七）微孔濾膜法（millipore filter method） 微孔濾膜法通常采用醋酸纖維素濾

16、膜或玻璃纖維素濾膜，在放免反應達到平衡后，將反應液加入裝有微孔濾膜的濾器上，抗原抗體復合物保留在濾膜上，游離部分被濾掉。 第二十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月五、數據處理（標準曲線擬合） RIA的數據處理是以標準品的檢測結果為依據，擬合出標準曲線，再通過標準曲線求出待測樣品的濃度值，標準曲線是衡量樣品的客觀尺度。標準曲線的擬合方式要慎重選擇，使它能夠真實的反應測量的結果，減少人為因素的引入。目前常用的方式為數學模型法。1、Logit-Log模型 Logit-Log轉換是使雙曲線直線化的最常用方法。它是將標準品濃度轉換成Log濃度，作為橫坐標，而把B轉換成LigitB，LigitB

17、=LogBx/（B0-Bx）。其中B0是0劑量結合率，Bx是任何劑量為X時的結合率（如圖）：第三十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 可以看出，這是一條隨劑量增加而下降的直線。這種方法的缺點是：由于劑量取對數，0劑量在擬合時不用，所以靈敏度有損失；如果反應系統(tǒng)不是理想模式，用本方法處理將有較大偏差。2、四參數Logistic模型 四參數Logistic模型是國際原子能機構（IAEA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的數據處理模型，是對Logit-Log模型的發(fā)展。其通式為：第三十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 其中X是抗原劑量

18、，Y是結合%，a、b、c、d為四個參數。對RIA來說，a可取實驗所得的最大結合率B0，b可取同一批數據用Logit-Log法作線性回歸所得的斜率，c可取使B0下降一半所需抗原濃度ED50，d可取實驗所得NSB。四參數Logistic模型的圖形如圖： 第三十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3、其他擬合模型 如四參數單位點作用模型的穩(wěn)定性較好，個別標準管出現壞點對擬合結果的影響較??；還有二次多項式擬合法、折線擬合法等。應當指出，不論采用何種數學模型進行曲線擬合，實驗的結果應該是相同的或相近的，都不能改善實驗過程低劣所帶來的影響。 第三十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月六、R

19、IA的分析誤差和質量控制 RIA是一類高靈敏度的超微量分析技術，易受各種因素的影響而使檢測結果失真。因此，質量控制體系應包括生產及使用兩個重要環(huán)節(jié)。作為生產廠家，應建立嚴格的質量檢測程序，以保證進入市場的產品都符合質量要求，這是首要環(huán)節(jié)。作為用戶則應建立嚴格的質量控制體系，以保證檢測的質量。根據不同的目的，質量控制體系可分為實驗室內部質量控制和實驗室間質量評價。 第三十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）誤差的來源 按誤差發(fā)生的統(tǒng)計學性質可將其分為：1、系統(tǒng)誤差（systematic error） 這種誤差常表現為檢測結果呈傾向性

20、的偏高或偏低，是一些可以確定的因素導致的。（1）方法誤差，如標準品稀釋體積不正確；（2）儀器和試劑誤差，如儀器狀態(tài)不佳；量器不準；（3）操作誤差，如不正確的操作習慣等。 系統(tǒng)誤差是可以通過努力消除的。 第三十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、隨機誤差（random error） 這種誤差是由偶然因素所引起，誤差的出現是隨機的，與真值的偏差是雙向的。常見的原因如加樣誤差，由分離劑或離心機造成的錯分誤差等。 （二）實驗室內部質量控制（internal quality control） 實驗室內部質量控制側重對檢測質量的控制，它保證從收集樣本開始到發(fā)出報告為止的全過程中，能及時發(fā)現檢測

21、過程中出現的各種誤差，分析產生的原因，找出糾正的辦法，以確保檢測的質量。常用的評價指標有精密度、準確度、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、有效性。第三十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1、精密度（precision） 精密度是指在相同的條件下，對某一樣品多次檢測所得結果的符合程度，即重復性。RIA系統(tǒng)的精密度是首先和隨時應考慮的，是最重要的質量參數。評價方法如下：（1）、標準誤差（SD）和變異系數第三十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、準確度（accuracy） 準確度是指測定值與真值的符合程度。考核符合程度的實踐往往需要多份測定的結果進行計算。準確度、精密度之間的關系：1準確

22、度、精密度均好。2準確度較好，精密度差。3準確度差，精密度好。4準確度、精密度均差。 第四十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗室內常用回收實驗，健全性試驗，“零”水平測定等評價方法的準確度。附回收率（recovery rate）的測定：（1）回收率：回收率是反應測定值偏差的質控指標，測定方法是設回收管和對照管，對照管中加入待測樣品，回收管中加入待測樣品和已知量的分析物，經過測定全過程，比較已知量和測得量之間的一致程度，理論上回收率一般為90%-110%之間，回收率的計算方法： 第四十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）：回收率:在實際工作中常常用更簡便的方法來計算回收

23、率?；厥章?測定值/質控管真值100%（3）質控樣品的應用： 1）質量控制樣品（quality control sample）為了更加準確的對樣本進行定量，我們使用質量控制樣品，它是含有一種或幾種測定物（其量值是經過標定的靶值），用來比較和評價測定系統(tǒng)的偏差和重復性的實驗用血清。2）對質控樣品的要求： A、質控樣品中的分析物應與待測樣品具有相同的生物學活性和免疫原性，其他組成成分也盡量相同。第四十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月B、質控樣品中分析物的濃度應是準確定量的，并且應有一個合理的濃度范圍，一般根據患者和正常人血清中被測物的濃度，制定高、中、低三個劑量水平，高者應小于標準曲線

24、的最大劑量點，中者應為標準曲線的中間劑量點，低者應大于標準曲線的最小劑量點，這樣能更好得發(fā)現整個檢測范圍內出現的變化，準確判斷誤差的性質和大小。C、在合理貯存的條件下，能長時間保存而不影響其性能，以便監(jiān)控測定系統(tǒng)的遠期重現性。D、質控樣品的管數約為總樣品管數的平方根，使用時將其分置于待測樣本的不同位置。 第四十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3、 靈敏度（sensitivity）靈敏度是指剛能與零標準管的測定結果在統(tǒng)計學上區(qū)別開來的最低濃度，即用該方法的最小可測值。計算方法是累積多批（一般為10次）測量結果，計算出零標準管的結合率為x-2SD時對應的劑量值，即為靈敏度。由此可見，靈

25、敏度和精密度有一定的關系，當精密度好時，零標準管的結合率較高，對應的濃度值較小，最小可測值較小，即靈敏度較高。 第四十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4、穩(wěn)定性（stability） 穩(wěn)定性是指測定試劑在合理保存和正確使用的條件下。在規(guī)定的有效期內，保持其全部性能不變。常用指標有：（1）零標準結合率：是指在沒有未標記配體存在下，由標記配體與結合劑之間產生的最大結合率，理論上不應低于33%，這個指標主要用來反應結合劑的質量，它在整個有效期內應保持穩(wěn)定。（2）非特異性結合率：它是指在沒有結合劑的存在下，標記配體被分離試劑結合造成的結合率，由于檢測過程中的種種原因，非特異性結合總會或多或

26、少地存在，一般應控制在5%以下。 第四十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5、特異性（specificity）： 特異性是指該反應體系不受干擾物質影響的程度，反映的是對分析物測定的專一程度。交叉反應率越小，反應體系對分析物測定的專一性越好。 6、有效性（affectivity）： 有效性主要是指臨床診斷符合率及臨床使用評價。檢測結果能有效地實現實驗目的，應有可信的正常值及正常范圍，在正常和異常之間應有良好的分離，以便得出結論，如有些要作有或無、陽性或陰性的回答，有些要確定濃度的高低等。第四十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 應該指出，上面提到的各種質控指標，對于全面評價檢

27、測系統(tǒng)的質量及檢測者的操作水平雖然是必要的，然而在實驗室常規(guī)檢測工作中，要完成如此眾多的質控指標是不可能的，也是沒有必要的。通常可根據實際需要和實驗室條件，選擇數項質控指標用于批內質量控制和批間質量控制。第四十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）實驗室外部質量評價（external quality control） 實驗室外部質量評價是對各實驗室之間的測定結果按統(tǒng)一的評價方案及方法比較分析，發(fā)現誤差，找出原因，提出改進辦法，以提高各實驗室之間所得結果的可信性和可比性。外部質量評價要在做好內部質量控制的基礎上才能進行。通常是根據工作需要，由一個負責單位來領導，提出計劃及要求，提供實

28、施外部質量評價用的統(tǒng)一樣品，分發(fā)至各參加單位進行檢測，然后將所得結果反饋給負責單位進行整理分析，對各有關單位的檢測質量進行評價，促進檢測質量的提高和資料的可比性。第四十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 免疫放射分析 免疫放射分析是利用過量放射標記抗體來測定樣品中的抗原或半抗原。所用的標記抗體是過量的，抗原全部是非標記的，所以反應系統(tǒng)是非競爭性的全量反應。為了與放射免疫分析法相區(qū)別，它的創(chuàng)始人Miles一開始就將其命名為免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）并一直沿用到現在。 第四十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、基本原理 放射

29、性核素標記在抗體上，然后以過量標記抗體與抗原結合，多余的抗體通過一定手段除去，測定復合物的放射性，其活度與待測抗原的量呈正相關。由于不存在競爭反應，其靈敏度明顯高于RIA。如下式表式：第五十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 IRMA中要分離的是游離抗體和復合物，都是大分子，一般分離方法難以奏效，目前主要靠單克隆抗體作分離劑。也就是每一IRMA系統(tǒng)至少要有兩個抗體，一個起分離作用，一個起測量作用。所以，一個IRMA方法的建立，至少需要兩個抗原決定簇，對很多小分子半抗原不適用。 （一）IRMA同樣遵循質量作用定律 IRMA的函數式也是雙曲線，若以B為縱坐標，它們是隨抗原量增加而上升的曲線

30、。第五十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、 IRMA的測量范圍寬 抗體含量越大，則欲達到飽和時所需要的抗原更多，這說明測量范圍寬。但標記抗體過高，游離抗體的量也增多，分離時將有明顯的分離誤差，使NSB升高，低濃度抗原的測量精密度降低。所以標記抗體的最佳濃度應通過實驗來選擇。第五十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）、IRMA和RIA的主要區(qū)別：第五十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、IRMA分類 （一）、雙抗體夾心法（double antibody sandwich method） 此法采用固相抗體

31、來代替經典的固相抗原的IRMA法，固相抗體先與待測物（或標準品）結合，再與標記的另一抗體反應，形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物，未結合抗體留在上清液中被棄去，測固相放射性。如下式表示：上式中的Ab1、*Ab2分別作為抗原上二個抗原決定簇的單抗，SP表示固相。第五十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）、標記雙抗法（labeled double antibody method） 標記抗體即為夾心法中那個標記抗體的抗體，亦即雙抗，這樣設計是為了簡化標記每一特異性抗體，只要標記這個雙抗體，即可作為通用示蹤劑，例如用125I標記了兔抗鼠的IgG，則所有應用非固相的鼠抗體作為第二抗體的，均

32、可用此標記的抗抗體作為示蹤劑，如下式表示： 第五十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）、雙標記抗體法（double labeled antibody method） 有些結構復雜的抗原有3個或更多個抗原決定簇，為此，可以用兩個標記抗體進行IRMA分析，以提高復合物的放射性比活度，從而提高方法靈敏度和精密度。最后形成的標記復合物見下圖： 第五十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、數據處理 采用計算機數學模型的方法進行處理，常用的數學模型包括：三參數單位點質量定律數學模型、五參數Logistic模型、線性內插模型等。第五十八張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四、免

33、疫放射分析的特點 （一）示蹤劑 IRMA法中的示蹤劑為標記抗體，是一種IgG蛋白分子，含有多個酪氨酸或組氨酸殘基，易被放射性碘化，目前示蹤劑的標記多用固相氧化劑碘化法，如Iodogen法等，很少影響其免疫活性，標記率可達70%左右。 （二）反應動力學 質量作用定律認為反應速度與反應物的濃度呈正比，在IRMA中標記抗體是過量的，且反應是非競爭性的，抗原抗體是全量反應，故反應速度比RIA法快，一般反應2-3小時即達平衡，當天出結果。第五十九張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）靈敏度 IRMA的靈敏度比 RIA有明顯的提高，約為10-100倍，這在某些分析項目中具有重要意義。如甲狀腺功能

34、主要指標有三項，即FT3、FT4的放免測定和TSH的IRMA測定，IRMA測定TSH能可靠的區(qū)分正常人和甲亢病人血清TSH含量的差別，只要TSH低于正常，FT3或FT4任一項高于正常即可診斷為甲亢，在復雜情況下，TRH試驗時TSH高于正常，應否定甲亢。 第六十張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）標準曲線的工作范圍 當選擇的標記抗體質和量適當，IRMA的工作范圍寬。一般情況下，待測物含量低者不必濃縮，高者不必稀釋，給臨床檢測帶來方便，也避免了由于濃縮和稀釋帶來的誤差。（五）特異性IRMA應用的固相抗體和標記抗體是分別針對抗原的兩個抗原決定簇的單抗，不易發(fā)生交叉反應，因此特異性高。 第

35、六十一張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（六）方法的穩(wěn)健性在免疫反應中，有些抗原抗體間的親和常數KA有明顯的溫度依賴性，降低溫度有利于KA值的提高，有利于增加靈敏度。根據質量作用定律，當抗體的濃度大于1/KA，KA的影響就明顯減少。IRMA中Ab0總是過量的，溫度對KA的影響較小，一般在4-37的溫度改變對實驗結果無明顯影響，所以IRMA常采用37溫育，反應平衡時間明顯縮短。方法的穩(wěn)健性好。 第六十二張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（七）IRMA的主要缺點 IRMA對蛋白和多肽抗原的檢測是優(yōu)越的。但它的典型的兩位點夾心法需要二個抗原決定簇的抗原，這就大大地限制了對短肽及其它半

36、抗原活性物的檢測。 第六十三張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 其它的非放射性 標記免疫分析法 在體外分析方法中，除了放射免疫分析和免疫放射分析外，還包括其它非放射性核素標記的免疫分析。如酶標記免疫分析，化學發(fā)光免疫測定，稀土元素標記的免疫分析法等。它們與前者一樣，都是利用抗原與抗體的結合具有高度特異性這一重要特性，而不同之處只是利用的標記示蹤物不同，因而其標記物的測定方法也不同。它們除了與前者同樣具有高度特異性及敏感性外，還克服了放射性核素可能造成的環(huán)境污染，保存期短等缺點，因此得到了廣泛的應用。 第六十四張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、酶標記免疫分析法 酶標記免

37、疫分析法（enzyme immunoassay，EIA）是以酶代替放射性核素標記抗體或抗原作為主要試劑的免疫測定法。它是將抗原抗體結合的高度特異性與酶促反應的高度敏感性有機的結合起來，用酶標記抗體（抗原），檢測待測標本中的未知抗原（抗體），當相應的抗原抗體特異性結合后，加入相應的酶的底物，酶可以高效專一催化和分解底物，生成有顏色的產物。根據顏色的有無和深淺，可以判斷待測標本中有無特異性抗原（抗體）以及量的多少。本實驗是一種敏感、特異、簡便，只需一般光譜分析儀器的微量測定技術。 第六十五張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、化學發(fā)光免疫分析法 化學發(fā)光免疫分析法（chemilumines

38、cences immunoassay，CLIA），是以化學發(fā)光物質代替放射性核素作為示蹤劑，將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高度特異的抗原抗體反應結合起來的一種超微量的分析法。其特點是：設備簡單，試劑穩(wěn)定，無放射性污染，自動化程度高。 第六十六張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、稀土元素標記的免疫分析法 稀土元素即鑭系元素，其中有銪（Eu）、鈦（Tb）、釤（Sm）、和鏑（Dy）四種元素能發(fā)射離子熒光，這些稀土元素的螯合物，可以與抗原抗體結合，所以又稱鑭系熒光免疫分析。此螯合劑上的稀土元素在紫外光的激發(fā)下，可產生持續(xù)一定時間，一定光峰的熒光。而其它非特異性熒光壽命很短，待其衰減后，測量鑭系元素的特異性熒光，可以完全排除背景熒光的干擾，此法又稱時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoimmunoassay，TrFIA）。 第六十七張，PPT共七十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 本法操作方便，靈敏度高，特異性強，無放射性，標記物穩(wěn)定性好，制備簡單并可長期保存，加之曲線劑量寬，自動化程度高（分析系統(tǒng)類似放免法）等優(yōu)點，深受生物醫(yī)學工作者的高度重視，目前國外生產的TRFIA 試劑盒包括甲狀腺激素、類固醇激素，病毒性肝炎標記物、腫瘤相關抗原、蛋白質類、藥物、多肽類和蛋白質類激素等，它們在基礎醫(yī)藥學和臨床醫(yī)學各領域的應用，必