由光譜學(xué)與電化學(xué)渠道檢測尼古丁

1、 可修改 歡送下載 精品 Word 可修改 歡送下載 精品 Word 可修改 歡送下載 精品 Word由光譜學(xué)與電化學(xué)渠道(qdo)檢測尼古丁對遺傳物質(zhì)DNA的作用(zuyng)Interaction of nicotine with DNA investigated via ultraviolet and electroanalysis methods 化學(xué)(huxu)與分子工程學(xué)院99級 劉玥 摘 要尼古丁,即煙堿(yn jin)3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶(bdng)在煙草中的重量含量約為1%2%，被公認(rèn)為是導(dǎo)致吸煙上癮的主要因子。研究它對DNA的作用以揭示其基因毒性對于闡釋尼古丁

2、的致癌致畸機(jī)制具有重要的意義。通過對DNA組分與結(jié)構(gòu)的詳細(xì)分析可知，對DNA復(fù)制起到加密作用的是堿基，而具有光學(xué)及電化學(xué)活性的也恰是A、T、G、C四種堿基，因此可將其作為光與電探測手段的入口點(diǎn)。研究證明紫外譜學(xué)的探測手段相對易行且有效，而電化學(xué)方法由于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將活性中心深藏其中從而對電極的設(shè)計(jì)提出很高的要求。原擬定用碳納米管修飾的玻碳電極來采集電信號，但實(shí)驗(yàn)證明效果并不理想?，F(xiàn)在嘗試一種新的但頗具潛力的解決方案。即利用甲基纖維素的負(fù)溫度敏感性將其制成高分子材料電極，DNA分子直接包覆其中。通過參加具備生物兼容性的電解質(zhì)同時解決降低凝膠點(diǎn)和導(dǎo)電的問題。AbstractConsumpti

3、on of tobacco is one of the most deadly threaten to human health. In this sense, it is urgent to investigate whether and how much nicotinecould impose an negative effect on the structure of DNA，therefore causing sufferings particularly from breathing system diseases. A detailed knowledge of the stru

4、cture of DNA suggests that it is both ultraviolet and electrical responsive. The ultraviolet spectrum of the mixture of DNA and nicotine proved the postulation that there do exist an interactionbetween molecules of nicotine and DNA. A certain adduct is probable. Electrodes modified with single wall

5、carbon nanotubes are adopted for eletroanalysis of DNA in solution, yet little responses had been detecteddue to double helix structure of DNA where active centers are deep hidden.Fortunately methylcellulose, a polymer material with thermogelation properties, had been brought into consideration for

6、designing a new electrode where in which molecules of DNA themselves are being trapped.It is a promising new method though highly postulating, and experimentsare being carried out to test its feasibility. 引言(ynyn)尼古丁,即煙堿(yn jin)3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶(bdng)在煙草中的重量(zhngling)含量約為1%2%。尼古丁不僅(bjn)能轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)致癌性的亞硝

7、胺化合物,而且被公認(rèn)為是導(dǎo)致吸煙上癮的主要因子。核酸是遺傳信息的載體，它可以與許多化合物發(fā)生相互作用如金屬離子及其絡(luò)合物、小分子有機(jī)化合物及蛋白質(zhì)等并進(jìn)而影響到核酸的復(fù)制及斷裂；本項(xiàng)研究那么是通過測定尼古丁和DNA之間的相互作用以揭示尼古丁的基因毒性。DNA是由許多單體組成的線形大分子，根本結(jié)構(gòu)重復(fù)單元是脫氧核苷酸，其組成結(jié)構(gòu)如下列圖所示： 磷酸DNA 脫氧核苷酸 D-2脫氧核糖脫氧核苷 腺嘌呤 堿基 鳥嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 (一).DNA的紫外吸收由于嘌呤和嘧啶殘基中含有共軛雙鍵結(jié)構(gòu),所以DNA具有強(qiáng)烈的紫外吸收性質(zhì),其最大波長在260nm處.正是由于它有這樣的光學(xué)活性,故而可以采用譜學(xué)探

8、測方法.(二). DNA的電化學(xué)1. DNA的電化學(xué)活性在DNA的組分中,堿基能發(fā)生氧化復(fù)原反響.鳥嘌呤和腺嘌呤可以在碳電極上氧化,鳥嘌呤, 腺嘌呤和胞嘧啶也可以在很負(fù)的電位下復(fù)原,故只能在貢電極上得到復(fù)原峰.基于此特性可將電化學(xué)的方法作為又一種探測手段。2. DNA在固體電極上的電化學(xué)氧化關(guān)于DNA電化學(xué)性質(zhì)的研究大多是在貢電極上進(jìn)行的，但是考慮到貢對于環(huán)境的污染 ，在本項(xiàng)研究中采用碳電極，主要針對DNA在碳電極上的氧化行為。已有報(bào)導(dǎo)觀測到變性DNA在電化學(xué)預(yù)處理過的玻碳電極上有較顯著的電化學(xué)行為用循環(huán)伏安法可以在0.8伏和1.1伏處得到兩個不可逆的氧化峰。但是，要研究尼古丁對人體的基因毒性

9、，自然要用天然的而不是已經(jīng)變性的DNA。DNA的組分(zfn)中，能發(fā)生電化學(xué)反響(fnxing)的只是(zhsh)堿基。然而DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)(jigu)又將其隱藏在雙螺旋內(nèi)部。DNA變性處理的實(shí)質(zhì)即為其二級結(jié)構(gòu)(jigu)的破壞。原本依靠配對堿基之間氫鍵作用維系的雙螺旋被翻開形成兩條單鏈。從而將包藏于內(nèi)部的堿基暴露出來，在電極上產(chǎn)生較強(qiáng)的電信號。3. DNA在修飾電極上電活性的改善單層碳納米管具有很好的電學(xué)性質(zhì)，可以作為一種特殊的電極材料來促進(jìn)電子的傳遞。碳納米管具有獨(dú)到的優(yōu)勢：極小的尺寸，極高的縱橫比，以及具有催化作用的外表。將其修飾在玻碳電極外表是一項(xiàng)很有研究價(jià)值的探測手段。 二.實(shí)驗(yàn)

10、PART I :紫外局部(一).儀器Cary IE紫外-可見分光光度計(jì)Varian公司。(二).試劑小牛胸腺DNA純度99%，購于sigma；尼古丁中國醫(yī)藥公司，北京采購供給站；石英亞沸三次重蒸水。(三).實(shí)驗(yàn)程序1.配置天然DNA溶液.用吸光光度法確定溶液的準(zhǔn)確濃度,由于核酸分子的摩爾質(zhì)量沒有確定值，故其精確的濃度應(yīng)用mg/ml來表達(dá).2.測定尼古丁與DNA作用后的紫外吸收。 配置多種濃度的DNA與Nicotine純?nèi)芤阂约岸喾N濃度配比的DNA+Nicotine混合溶液分別測定，用計(jì)算機(jī)作圖并扣除相應(yīng)濃度的尼古丁溶液的吸收以初步觀察尼古丁對DNA的紫外吸收有何影響。3.以相應(yīng)濃度的尼古丁溶液

11、為空白測定混合溶液的紫外吸收。PART II:電化學(xué)局部(一).儀器M273恒電位儀及M270電化學(xué)分析系統(tǒng)EG&G, PAR公司，美國；三電極體系：工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極SCE,對電極為鉑電極；(二).試劑小牛胸腺DNA純度99%，購于sigma；尼古丁中國醫(yī)藥公司，北京采購供給站；單層碳納米管SWNT(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院制備)；石英亞沸三次重蒸水。(三).實(shí)驗(yàn)(shyn)程序玻碳電極(dinj)的修飾 將玻碳電極在金相(jn xin)砂紙上拋光,在麂皮(j p)上用Al2O3粉末拋光至鏡面，然后(rnhu)分別用水和乙醇在超聲波中清洗，晾干。再用微量注射器取15

12、微升單層碳納米管懸浮液分三次滴加在玻碳電極外表，至于紅外燈下待溶劑揮發(fā)。用循環(huán)伏安法掃描測定DNA溶液電化學(xué)響應(yīng) 將1mg/ml的DNA儲藏液稀釋至0.02mg/ml.測定在0.1M磷酸緩沖液中PH7.2 進(jìn)行。首先，碳納米管修飾電極在攪拌的DNA溶液中開路狀態(tài)下富集5min,靜至5s，在掃速為100mV/s時從0.2V掃描到1.2V記錄循環(huán)伏安曲線。用循環(huán)伏安法掃描測定DNA與Nicotine混合溶液的電化學(xué)響應(yīng)配置多種濃度配比的DNA+Nicotine混合溶液分別測定，以確定尼古丁對DNA的電化學(xué)響應(yīng)有何影響。三.結(jié)果與討論P(yáng)art I:紫外局部 1.DNA的濃度測定A(稀釋25倍)B(稀

13、釋10倍)C(稀釋5倍)Wavelength/nm259.00258.00257.00Abs0.69391.76003.1526表1.測定DNA儲藏液濃度的三份不同稀釋倍數(shù)測試液的紫外吸收峰值。當(dāng)吸光度為1.0時對應(yīng)的DNA溶液濃度為0.06mg/ml。測得其濃度為1.01 mg/ml。DNA溶液摩爾吸光系數(shù)=6600 mol-1.L -1故DNA溶液摩爾濃度約為2.5X10-3mol/L。圖1. 測定DNA儲藏液濃度的三份不同稀釋倍數(shù)測試液的紫外吸收圖。2.DNA與尼古丁混合溶液的紫外吸收混合溶液的吸收譜圖用計(jì)算機(jī)扣除尼古丁的吸收后，其結(jié)果初步證明尼古丁的存在使得DNA在260nm處紫外吸收

14、峰的峰高發(fā)生變化。即與DNA分子發(fā)生相互作用。更準(zhǔn)確的結(jié)果可通過實(shí)驗(yàn)直接將尼古丁的吸收作為空白扣除。3.以尼古丁為空白的混合溶液的紫外吸收樣品123空白nicotine5.0X10-5mol/Lnicotine(1.0X10-4mol/L)nicotine (2.5X10-4mol/L)混合樣品DNA5X10-5mol/L +nicotine5.0X10-5mol/LDNA5X10-5mol/L+nicotine(1.0X10-4mol/L)DNA5X10-5mol/L+ nicotine(2.5X10-4mol/L)表2.各混合(hnh)液體中DNA與Nicotine的濃度(nngd)比及其

15、相應(yīng)空白尼古丁溶液的濃度圖2.純尼古丁溶液(rngy)A與各混合(hnh)溶液(B.C.D.)的紫外吸收(xshu)圖.樣品峰高與純DNA吸收值之差A(yù)0.329B(1:1)0.3390.0103%C(1:2)0.3630.0247%D(1:5)0.4180.05513%表3. 將各混合溶液在260nm處的紫外吸收與純DNA溶液在該波長的吸收值之差圖3.尼古丁存在(cnzi)時引起DNA紫外吸收(xshu)的改變對尼古丁濃度的線性擬和Part II:電化學(xué)局部(jb) 循環(huán)伏安法掃描(somio)未得到預(yù)想的電化學(xué)響應(yīng)信號,說明(shumng)堿基在雙螺旋中隱藏較深, 玻碳電極上修飾的碳納米管還

16、缺乏以深入雙鏈內(nèi)部采集電信號.暑期我在臺灣新竹清華大學(xué)進(jìn)行的高分子材料方面的研究給予我很大啟發(fā),我所作的關(guān)于甲基纖維素的研究為這里要攻克的難題提供了一種新的解決方案.(一).甲基纖維素的負(fù)溫度敏感性 通常情況下,高分子在低溫下呈凝膠狀.隨著溫度的升高,黏度逐漸降低.當(dāng)溫度超過臨界值那么呈現(xiàn)溶液狀態(tài).而甲基纖維素是一個獨(dú)特的例子.它只在低溫時能形成溶液,溫度愈高,黏度愈大.凝膠點(diǎn)為800C.這種獨(dú)特的負(fù)溫度敏感性，使得它具有廣闊的應(yīng)用前景。譬如：在藥物制放系統(tǒng)中，很多大分子的藥物需要一種特殊的載體。常溫下為溶液狀態(tài)，進(jìn)入人體到達(dá)治療部位后，藥物的包覆材料變?yōu)槟z狀從而防止了藥物立即擴(kuò)散，達(dá)不到治

17、療所需的濃度。負(fù)溫度敏感性材料如甲基纖維素之所以受到關(guān)注也正因如此。關(guān)鍵的地方是要將甲基纖維素的凝膠溫度由800C變?yōu)?70C。 一種方法是向甲基纖維素的水溶液中參加對生物體無毒的添加劑。已實(shí)驗(yàn)過有NaCl、CaCl2和蔗糖。其效果相當(dāng)顯著。其可能的機(jī)理如下列圖所示：a.低溫(dwn)下的高分子鏈b.隨著溫度升高，支鏈的轉(zhuǎn)動越來越劇烈(jli)，導(dǎo)致鏈端張開將甲基暴露出來。c.包圍(bowi)在甲基周圍的水分子被排開，各高分子鏈通過甲基之間的疏水相互作用彼此交聯(lián)從而形成凝膠。圖4.凝膠過程(guchng)示意細(xì)線為至鏈稀疏(xsh)區(qū),粗線反之.當(dāng)溶液中有添加劑時,會對凝膠過程有一定影響.雖然

18、溶液是均相的,當(dāng)對于一微觀區(qū)域并非如此.以CaCl2為例，被困在高分子鏈之間的離子數(shù)量遠(yuǎn)少于游動在之外廣闊的水域中的數(shù)量圖4a。這種內(nèi)外濃度的差異就造成了滲透壓，高分子束即可看作半透膜。當(dāng)鏈端張開時圖4b，由于滲透壓的存在，使得高分子鏈?zhǔn)鴥?nèi)的水分子流出，從而暴露出甲基加速了交聯(lián)作用，并導(dǎo)致凝膠點(diǎn)下降。圖5.甲基纖維素的凝膠點(diǎn)對蔗糖濃度的線性擬和圖6. 甲基纖維素的凝膠點(diǎn)對CaCl2濃度(nngd)的線性擬和二. 甲基纖維素對DNA的電化學(xué)響應(yīng)(xingyng)的意義DNA具有(jyu)電化學(xué)活性位點(diǎn)，存在的問題是找到適宜(shy)的電極(dinj)去采集應(yīng)有的電信號?？梢钥紤]將DNA直接包覆于

19、電極中，甲基纖維素恰是一種理想的可應(yīng)用高分子材料。首先它可以在較低溫度370C結(jié)成凝膠狀作為電極，此溫度又恰好可以使實(shí)驗(yàn)條件更好的模擬人體的生理環(huán)境。其次，材料的導(dǎo)電性需參加電解質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，而NaCl、CaCl2等常用的電解質(zhì)又正是降低甲基纖維素凝膠溫度所需的添加劑。這樣制成的電極應(yīng)該會有改善，具體的工作正在進(jìn)行之中。致 謝在此論文完成之際,我要衷心感謝所有在此期間給于我指導(dǎo)和幫助的人!感謝我的指導(dǎo)老師莊乾坤教授在思想方法,學(xué)術(shù)態(tài)度,科研精神等各個方面給予我太多的啟迪和指導(dǎo)。與莊老師每一次討論之后都會有豁然開朗之感,使我充滿熱情和信心地投入到下一步的研究中去。感謝臺灣新竹清華大學(xué)的宋信文教授在赴

20、臺交流期間給予我的悉心指導(dǎo)和細(xì)致關(guān)心,使我能夠順利的完成在臺灣的研究方案,并在短暫的暑假期間受益良多。同時對生醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的各位學(xué)長與學(xué)姐致以謝意,感謝他們的幫助。還要感謝同實(shí)驗(yàn)室的甘鎮(zhèn)海,趙強(qiáng),趙怡芳等諸位師兄師姐在整個過程中的熱情幫助,使我能夠順利的投入到研究工作中去。最后,真誠地感謝“政基金給我們提供了如此難得自我開展的時機(jī)。感謝李政道先生。感謝“政基金委員會的各位老師。參考文獻(xiàn)1 J.Marmur, J.Mol.Biol. 1961,3,208.2 S.Yamada, H.Sato, Nature, 1962,193,261.3G.M.Tenkins, K.Kawamura, Nature

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