高效液相色譜法測(cè)定左亞葉酸鈣注射液有關(guān)物質(zhì)的條件研究

1、高效液相色譜法測(cè)定左亞葉酸鈣注射液有關(guān)物質(zhì)的條件研究【摘要】目的創(chuàng)立左亞葉酸鈣注射液有關(guān)物質(zhì)測(cè)定要領(lǐng)。要領(lǐng)接納反相離子對(duì)試劑高效液相色譜法，色譜柱為Varian182504.6,5，活動(dòng)相：磷酸氫二鈉2.2g加10%四丁基氫氧化銨8l，以水稀釋到780l，用110磷酸調(diào)治pH至7.8:甲醇為78:22；流速：1.0l/in；柱溫：40；檢測(cè)波長(zhǎng)286n。結(jié)果左亞葉酸鈣質(zhì)量濃度為0.04120g/l內(nèi)，線性干系精良r=0.9999。結(jié)論要領(lǐng)專屬性好，正確，敏捷，用于左亞葉酸鈣注射液有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果可靠?！娟P(guān)鍵詞】高效液相色譜法；左亞葉酸鈣注射液；有關(guān)物質(zhì)；10甲酰葉酸【Keyrds】HPL；al

2、iulevfliaidinjetin；relatedsubstane；10-frylfliaid左亞葉酸鈣注射液是接納經(jīng)手性拆分亞葉酸鈣后所得左亞葉酸鈣質(zhì)料藥配制而得的一種手性藥物注射劑。其普及用于血虛、腫瘤的治療。該品種是安徽省科隆藥物研究所研制的一個(gè)新藥。原有的HPL有關(guān)物質(zhì)測(cè)定要領(lǐng)色譜條件為：18柱2504.6,5,流速1.0l/in，柱溫：40，活動(dòng)相：磷酸氫二鈉2.2g加10%四丁基氫氧化銨2l，以水稀釋到780l，用110磷酸調(diào)治pH至7.5:甲醇為78:22，供試液濃度：0.14g/l。但是在用該色譜條件舉行測(cè)定左亞葉酸鈣注射液有關(guān)物質(zhì)時(shí)，創(chuàng)造雜質(zhì)峰沒能得到基線分散，且不克不及檢

3、測(cè)到雜質(zhì)10甲酰葉酸。按照同系物HPL色譜條件相近原那么，參考?中國(guó)藥典?12022年版注射用亞葉酸鈣凍干粉針有關(guān)物質(zhì)測(cè)定色譜條件及?歐洲藥典?2左亞葉酸鈣質(zhì)料藥有關(guān)物質(zhì)測(cè)定色譜條件，在此底子上用四點(diǎn)法求出容量因子對(duì)離子對(duì)試劑濃度和pH值的回歸多項(xiàng)式，進(jìn)而求得活動(dòng)相離子對(duì)試劑濃度和pH值的最正確值。1儀器與試劑1.1儀器Agilent1100液相色譜儀，包羅Agilent色譜事情站，單位泵，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，外配AT-130柱溫箱，TU-1800紫外可見分光光度計(jì)。1.2試劑甲醇：色譜純。磷酸氫二鈉，10%四丁基氫氧化銨水溶液，磷酸，均為闡發(fā)純。左亞葉酸鈣比較品含量99.2%，水分17%，批

4、號(hào)20221029;亞葉酸鈣消旋體含量99.2%，水分11.7%，批號(hào)20220820;10甲酰葉酸?美國(guó)藥典?成認(rèn)尺度品，含量99.5%。左亞葉酸鈣注射液本公司消費(fèi)，批號(hào)050701，50g/5l。2色譜條件色譜柱：Varian182504.6,5;流速：1.0l/in;柱溫：40;檢測(cè)波長(zhǎng)：286n;進(jìn)樣量：20l。3四點(diǎn)法求出各組分峰相應(yīng)面多項(xiàng)式按Shenakers公式組分的容量因子k的對(duì)數(shù)和常用色譜參數(shù)活動(dòng)相中強(qiáng)溶劑的比例，pH值，柱溫-1等呈一次或二次線性干系3，對(duì)二參數(shù)即二因子體系可接納以下公式Lnk=0+1x1+2x2+12x1x2，在本實(shí)行中把公式定為L(zhǎng)nk=A+B+pH+Dp

5、H此中A、B、D為多項(xiàng)式的不決系數(shù)，為離子對(duì)試劑濃度g/l，pH為活動(dòng)相終極pH值，按照亞葉酸鈣有關(guān)物質(zhì)測(cè)定HPL色譜條件為0.8g/l，pH為8.28，取用濃度為0.1g/l的左亞葉酸鈣注射液水溶液用該色譜條件舉行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，色譜圖見圖1。略創(chuàng)造各雜質(zhì)峰根本能得到基線分散，并能檢測(cè)出10甲酰葉酸雜質(zhì)峰，設(shè)定另三個(gè)實(shí)行點(diǎn)為：0.8g/l，pH：8.14，：1.13g/l，pH：8.28，：1.13g/l，pH：8.14。按k=t-t0/t0，盤算出4個(gè)實(shí)行點(diǎn)各組分峰的k，代入Lnk=A+B+pH+DpH，求出9個(gè)峰的容量因子k相應(yīng)面多項(xiàng)式為：Lnk1=-33.63566+27.13161+4

6、.04900pH-3.34589pHLnk2=-17.41685+14.07742+2.08591pH-1.71515pHLnk3=-16.72214+13.46845+1.99667pH-1.61905pHLnk4=-11.47669+9.01227+1.36901pH-1.07591pHLnk5=-11.98090+8.9332+1.43346pH-1.06335pHLnk6=-9.79820+7.70891+1.17938pH-0.91020pHLnk7=-9.43013+6.88176+1.14269pH-0.80801pHLnk8=-8.84756+6.48648+1.08823pH

7、-0.75779pHLnk9=-6.72357+4.10918+0.84392pH-0.44892pH此中第五峰為最難分散物質(zhì)對(duì)峰按：Lnk5=8.9332-1.06335pH0得pH=8.40Lnk5pH=1.4336-1.06335得=1.35g/l求得色譜條件中和pH的上限值為：1.35g/l，pH：8.40。在：1.35g/l，pH：8.28和：0.8g/l，pH：8.40條件下對(duì)左亞葉酸鈣注射液舉行有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，綜合比力已做的四個(gè)實(shí)行點(diǎn)色譜圖，以：0.8g/l，pH：8.28和：1.13g/l，pH：8.28兩個(gè)實(shí)行點(diǎn)得出的色譜圖各峰均得到較好的分散。色譜圖見圖2。4要領(lǐng)專屬性觀察

8、4.1輔料的滋擾性實(shí)行按左亞葉酸鈣注射液處方比例配制空缺樣品，用水配制成.1g/l的溶液，汲取20l進(jìn)樣，記載色譜圖見圖3A，可見處方中的輔料對(duì)測(cè)定無滋擾。4.6光照粉碎實(shí)行取左亞葉酸鈣注射液1支，置4500LX的強(qiáng)光下，安排10天，配制0.1g/l的水溶液，進(jìn)樣20l，記載色譜圖見圖3F。圖2：1.13g/lpH：8.28所得左亞葉酸鈣注射液色譜圖Fig2aluiLevflinateInjetinHPLhratgrasf：1.13g/lpH：8.28圖3要領(lǐng)專屬性觀察圖譜Fig3HPLhratgrasftheexlutininspetinfethdA.空缺溶液blankslutin；B.比較

9、品溶液refereneslutin.氧化粉碎試驗(yàn)thexidativedestryedtest；D.酸粉碎試驗(yàn)theaiddestryedtestE.堿粉碎試驗(yàn)thebasedestryedtest；F.光照粉碎試驗(yàn)thelightdestryedtest5線性干系觀察稱取5.03g10甲酰葉酸至50l容量瓶?jī)?nèi)，用活動(dòng)相定容至刻度作為母液，別離量取母液配制成含10甲酰葉酸0.1、0.2、0.5、1、2、4g/l的水溶液，別離取20l進(jìn)樣，每個(gè)樣品各進(jìn)樣3次，盤算峰面積的均勻值，3次峰面積的RSD均小于2%，以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度，g/l為橫坐標(biāo)，舉行回歸處置懲罰，尺度曲線方程為A=28.81

10、2-0.63894，r=0.9999。在0.14.0g/l濃度范疇內(nèi)線性干系精良。稱取左亞葉酸鈣尺度品含量99.2%，水分17%，用水配制成含左亞葉酸鈣120、100、4、2、1、0.04g/l的水溶液，別離取20l進(jìn)樣，每個(gè)樣品各進(jìn)樣3次，盤算峰面積的均勻值，3次峰面積的RSD值均小于2%，以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度，g/l為橫坐標(biāo)，舉行回歸處置懲罰，尺度曲線方程為A=79246.3+0.058548，r=0.9999。在0.04120g/l濃度范疇內(nèi)線性干系精良。6加樣接納率安徽省科隆藥物研究所提供的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定要領(lǐng)中，有雜質(zhì)10甲酰葉酸的含量限定。參考?歐洲藥典?左亞葉酸鈣質(zhì)料藥有關(guān)物質(zhì)測(cè)

11、定要領(lǐng)和?中國(guó)藥典?2022年版二部注射用亞葉酸鈣有關(guān)物質(zhì)測(cè)定要領(lǐng)，將左亞葉酸鈣注射液有關(guān)物質(zhì)測(cè)定要領(lǐng)中供試液的濃度定為0.1g/l。取左亞葉酸鈣注射液和10甲酰葉酸尺度品配制成濃度為0.05g/l的供試液及0.001g/l的比較液，別離進(jìn)樣。按照供試液和比較液色譜圖中10甲酰葉酸峰的面積，用上述供試液和比較液，別離配制10甲酰葉酸含量相對(duì)尺度50%、80%、120%的供試液各3份，每份進(jìn)樣3次，盤算得均勻加樣接納率n=3別離為：106.9%、110.0、108.4%，RSD別離為1.68%、1.19%、0.46%。7細(xì)密度及溶液不變性實(shí)行用左亞葉酸鈣注射液和10甲酰葉酸比較品配制成濃度別離為

12、0.1g/l和0.001g/l的溶液，一連進(jìn)樣6次，RSD別離為1.51%和0.43%，取上述溶液室溫安排，別離于0、2、4、8、12、24h取樣測(cè)定，峰面積的RSD別離為：1.10%、0.80%。表白左亞葉酸鈣注射液水溶液和10甲酰葉酸水溶液在室溫下安排24h不變性精良。8白天細(xì)密度和重復(fù)性實(shí)行用左亞葉酸鈣注射液配成0.1g/l的水溶液6份和0.001g/l10甲酰葉酸尺度品水溶液6份，別離進(jìn)樣20l，有關(guān)物質(zhì)總量別離為2.30%、2.30%、2.31%、2.31%、2.30%、2.30%，10甲酰葉酸量為限度的0.64%、0.70%、0.69%、0.70%、0.67%、0.65%，RSD為

13、0.22%、3.83%。取上述溶液別離在1、5、10天內(nèi)由差異職員別離進(jìn)樣，測(cè)得10甲酰葉酸和有關(guān)物質(zhì)總量別離為0.64%、0.69%，0.65%、2.30%，2.30%、2.31%，RSD別離為4.0%、0.25%。92022年版?中國(guó)藥典?和?歐洲藥典?及本次實(shí)行要領(lǐng)差異性闡發(fā)?歐洲藥典?2022年版有左亞葉酸鈣質(zhì)料藥有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，無制劑的測(cè)定要領(lǐng)。?中國(guó)藥典?2022年版只有亞葉酸鈣質(zhì)料、凍干粉針有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，左亞葉酸鈣質(zhì)料及制劑尚未上2022年版?中國(guó)藥典?。?中國(guó)藥典?和?歐洲藥典?對(duì)亞葉酸鈣和左亞葉酸鈣有關(guān)物質(zhì)測(cè)定都接納溶液濃度1g/l，280n的檢測(cè)波長(zhǎng)，?中國(guó)藥典?接納自身

14、比較，?歐洲藥典?接納亞葉酸鈣尺度品作為比較而進(jìn)樣量那么為10l。?歐洲藥典?和本次實(shí)行接納的10甲酰葉酸比較液的濃度別離為0.005g/l和0.001g/l，限度均為小于比較液的0.8倍,?中國(guó)藥典?無10甲酰葉酸限度項(xiàng)。筆者按照上述條件及本人本次實(shí)行所接納的條件，別離接納280n，286n檢測(cè)波長(zhǎng)和左亞葉酸鈣供試液濃度0.1g/l和1g/l及10l、20l進(jìn)樣量舉行測(cè)定，所得結(jié)果如下。表1差異波長(zhǎng)、供試液和進(jìn)樣量所得10甲酰葉酸和有關(guān)物質(zhì)總量略從上述結(jié)果可以看出接納左亞葉酸鈣注射液供試液濃度0.1g/l及進(jìn)樣量10l，檢測(cè)波長(zhǎng)280n、286n所得數(shù)據(jù)差異較小，而接納1g/l20l進(jìn)樣量時(shí)

15、所得數(shù)據(jù)差異較大，這是由于1g/l10甲酰葉酸在280n出現(xiàn)汲取峰，0.001g/l左亞葉酸鈣、0.01g/l亞葉酸鈣消旋體在286n處出現(xiàn)汲取峰之故。10討論在確定了活動(dòng)相強(qiáng)溶劑比例、柱溫、流速等參數(shù)后，對(duì)利用離子對(duì)試劑的活動(dòng)相體系，在離子對(duì)試劑濃度及pH值為不決因子時(shí)可通過對(duì)用Shenakers公式導(dǎo)出的最難分散物質(zhì)對(duì)色譜峰相應(yīng)面多項(xiàng)式求偏導(dǎo)數(shù)的要領(lǐng)，求出離子對(duì)濃度和pH值的上邊界值，進(jìn)而接納體系優(yōu)化的要領(lǐng)求出最正確活動(dòng)相構(gòu)成。該要領(lǐng)大概對(duì)不具有體系優(yōu)化軟件的企業(yè)來說不失為一種探求高效液相色譜最優(yōu)條件的要領(lǐng)4。接納反相離子對(duì)試劑體系測(cè)定極性化合物的有關(guān)物質(zhì)時(shí)，同比例縮小離子對(duì)試劑和供試液濃度，不克不