Abbkine免疫(共)沉淀磁珠-瓊脂糖實(shí)驗(yàn)步驟

1、Abbkine丨免疫（共）沉淀磁珠/瓊脂糖實(shí)驗(yàn)步驟免疫沉淀（IP）是利用固定在磁珠或瓊脂糖樹脂等固相支持物上的特異性抗體對抗原進(jìn)行小型親和純化的方法。需要從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術(shù)的蛋白和其他生物分子時(shí)，免疫沉淀是常用的方法之一。接下來就和abbkine一起分享一下 HYPERLINK /ip-co-ip-4/ 免疫（共）沉淀磁珠/免疫（共）沉淀瓊脂糖的相關(guān)問題。什么是免疫共沉淀？免疫共沉淀的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)具有生理性相互作

2、用的有效方法。優(yōu)點(diǎn)：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物；能夠?qū)﹂g接相互作用的蛋白進(jìn)行捕獲，比如對蛋白復(fù)合物的多種成分進(jìn)行鑒定；可以研究具有修飾的目的蛋白；操作流程較為簡便，不需要事先制備大規(guī)模蛋白表達(dá)文庫。缺點(diǎn)：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；不能判斷直接互作還是間接互作，兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇特異的檢測抗體，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性；靈敏度沒有親和色譜高；可

3、能因?yàn)槎喾N非特異性吸附帶來假陽性結(jié)果，因此需要設(shè)置嚴(yán)格的對照。免疫共沉淀（Co-IP）具體實(shí)驗(yàn)方法免疫共沉淀的大致流程如下：準(zhǔn)備蛋白樣品-抗原抗體結(jié)合-proteinA/G與抗體結(jié)合-免疫共沉淀分離-WB/MS分析出報(bào)告免疫共沉淀的具體操作步驟如下：(1)取20L的Protein A/G Magnetic Beads加入到1.5mL離心管中，離心管置于磁分離架上，靜置10s，吸棄上清。(2)加入1mL1Wash Buffer，重懸Protein A/G Magnetic Beads，離心管置于磁分離架上，靜置10s，吸棄上清，重復(fù)3次。(3)加入0.2-2g抗體溶液，重懸Protein A/G

4、 Magnetic Beads，室溫下置于垂直旋轉(zhuǎn)混合儀孵育30min，離心管置于磁分離架上，靜置10s，收集上清液，沉淀用于后續(xù)Step(4)?？蛇x做，IgG陰性對照：加入0.2-2LMouseIgG或Rabbit IgG，重懸Protein A/G Magnetic Beads，室溫下置于垂直旋轉(zhuǎn)混合儀孵育30min，離心管置于磁分離架上，靜置10s，收集上清液，沉淀用于后續(xù)Step(4)。此步可排除IgG本身和目的蛋白或其它特定生物分子的非特異性結(jié)合。注意：Protein A/G Magnetic Beads置于垂直旋轉(zhuǎn)混合儀混勻時(shí)，要保證有一定的流動性，若不流動，加入一定量的1Wash

5、 Buffer。(4)加入1mL1Wash Buffer，重懸Protein A/G Magnetic Beads，離心管置于磁分離架上，靜置10s，吸棄上清，重復(fù)3次。(5)加入0.2-1mL（0.2-1mg）蛋白樣品或上清(去除非特異性結(jié)合蛋白的上清)，在室溫下置于垂直旋轉(zhuǎn)混合儀孵育1h或4過夜。(6)離心管置于磁分離架上，靜置10s，收集上清液，沉淀用于后續(xù)Step(7)。(7)加入1mL1Wash Buffer，重懸Protein A/G Magnetic Beads，離心管置于磁分離架上，靜置10s，吸棄上清，重復(fù)3次。(8)洗脫a）變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于SDS和Western Blotting檢測。向離心管中加入20-50L1SDSLoading Buffer混合均勻，100加熱5min，然后進(jìn)行離心，800rpm離心1min，收集上清液，進(jìn)行SDS和Western Blotting檢測分析。b）非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心管中加入20-50LElutionBuffer混勻，然后在室溫下孵育10min，800rpm，4，離心2min，收集上清液至新的離心管中，并立即加入1/10ElutionBuffer體積的Neutralization Buffer，將洗脫組分pH調(diào)節(jié)至7.0-8.0，用于后