分子生物學(xué)PBL-基因表達(dá)檢測(cè)

1、分子生物學(xué)PBL-基因表達(dá)檢測(cè)基因表達(dá)的檢測(cè)1.DNA2.mRNA3.蛋白質(zhì)水平 Northern RT-PCRRT-RNA （Reverse Transcription RNA） 反轉(zhuǎn)錄PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。 mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 可作為 PCR 的模板進(jìn)行擴(kuò)增，這種在 mRNA 反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行的 PCR 擴(kuò)增稱為 RT-PCR 。Reverse Transcription PCR RNA提取cDNA反轉(zhuǎn)錄PCRNorthern 印記雜交基因表達(dá)分析Northern印記雜交基因表達(dá)水平隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)Oligo(dT)引導(dǎo)特異性引導(dǎo)1 隨機(jī)六聚體引

2、物：用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。2 Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Poly(A )尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。3 特異性引物：用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。*反轉(zhuǎn)錄可用的引物四個(gè)問(wèn)題1234在GenBank查找p53基因序列 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物確定RT-PCR的參數(shù) 檢測(cè) p53基因在血細(xì)胞中的表達(dá)情況 一、查找p53序列p53基

3、因的序列（AF136270.1） 使用Genbank 引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。 二、如何設(shè)計(jì)引物？引物設(shè)計(jì)的一般原則：a.長(zhǎng)度及堿基分布 引物長(zhǎng)度一般為10-30個(gè)核苷酸 四種堿基的分布應(yīng)遵循隨機(jī)原則 G+C含量一般為40%-60%b.引物之間及引物自身 兩種引物間不應(yīng)有互補(bǔ)性 一對(duì)引物間不應(yīng)有多于四個(gè)連續(xù)堿

4、基互補(bǔ) 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列c.引物3端 不能進(jìn)行任何修飾 不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能 3端盡量避免為T d.引物5端 5端無(wú)嚴(yán)格限制根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置。PrimerPremier5.0是由加拿大的Premier公司開(kāi)發(fā)的專業(yè)用于PCR或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（Genetank），引物設(shè)計(jì)窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引物設(shè)計(jì)功能。PrimerPremie

5、r5.0啟動(dòng)界面在此輸入需擴(kuò)增的DNA序列Hairpin：發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer：二聚體False Priming：錯(cuò)配Cross Dimer：交叉二聚體保存選擇滿意的引物所選引物使用PDF虛擬打印三、RT-PCR參數(shù)的設(shè)定cDNA size: 421 bp反應(yīng)程序： 變性 94度 30秒， 退火55度 45秒， 延伸 72度 60秒， 27個(gè)循環(huán).變性：模板DNA由雙鏈變成單鏈，有利于與引物結(jié)合?？筛鶕?jù)模板的復(fù)雜程度調(diào)整變性溫度和時(shí)間，一般情況下94C 30秒可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。退火：變性的DNA快速冷卻至4060C可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合?？筛鶕?jù)引物的長(zhǎng)度和GC的含量選擇復(fù)性溫度。循環(huán)條件的設(shè)定：延伸：一般是7075C，此時(shí)Taq DNA聚合酶活性最高。1kb的可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。循環(huán)次數(shù)：理論上2025個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物的累計(jì)即可達(dá)到最大值、實(shí)際操作中2530較合理。循環(huán)條件的設(shè)定：四、檢測(cè)p53基因的表達(dá)： 根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠，取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣