層析技術(shù)習(xí)題

1、層析技術(shù)習(xí)題一、選擇題 層析圖是指 （C）A.某組分的流出曲線(xiàn)B.某組分的層析峰C.整個(gè)層析分離過(guò)程所得的各組分流出曲線(xiàn)D.層析分離過(guò)程所得的單組分流出體積在層析技術(shù)中，分配系數(shù)是指 （A ）A.一種化合物在固相與流動(dòng)相中的分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比B.二種化合物在固相與流動(dòng)相中的分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比C. 一種化合物在固相與流動(dòng)相中的分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比D.二種化合物在固相與流動(dòng)相中的分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比 TOC o 1-5 h z 下列哪項(xiàng)不是層析技術(shù)中的速率理論指出的影響柱效的因素： （D ）A.渦流擴(kuò)散B.分子擴(kuò)散C.傳質(zhì)阻力D.理論塔板高度下列哪項(xiàng)不是吸附層析常用的吸附劑： （D ）

2、A.氧化鋁B.硅月里C.活性炭D.瓊脂糖凝膠層析分離混合物的基本原理是： （B ）A.吸附力差異B.分子篩作用C.離子交換D.配體親和差異關(guān)于離子交換層析的描述下列哪一項(xiàng)不正確： （B ）A.離子交換劑通常不溶于水B.陽(yáng)離子交換劑常可離解出帶正電的基團(tuán)C.陰離子交換劑?？呻x解出帶正電的基團(tuán)D.陽(yáng)離子交換劑?？呻x解出帶負(fù)電的基團(tuán) TOC o 1-5 h z 分離鑒定氨基酸的紙層析屬于 （D）A、親和層析B、吸附層析C、離子交換層析D、分配層析二、是非題（對(duì)的打“ / ,錯(cuò)的打“X”）色譜法就是分離有色物質(zhì)的方法。 （X）層析法的最大特點(diǎn)是分離效率高，但它只能分離各種性質(zhì)相類(lèi)似的物質(zhì)。（X）固定相

3、是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液）。 （V）分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比值。 （V）遷移率（或比移值 Rf）是指：在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值。 （V）在層析分析中，通常是根據(jù)層析峰的位置來(lái)進(jìn)行定性分析，根據(jù)層析峰的面積或高度進(jìn)行定量分析的。 （V）凝膠層析只能分離分子量相差懸殊的混合物，如Hb與CuSO4（X）Q柱層析中，當(dāng)柱長(zhǎng) L 一定，理論塔板數(shù) n愈大，柱效愈低。-（X） 填空題、柱層析中，當(dāng)柱長(zhǎng) L 一

4、定，理論塔板數(shù) n愈大，柱效愈高。柱層析法的定量依據(jù)是層析峰的峰高和峰面積。凝膠層析法分離血紅蛋白和CuS04昆合液，先流出層析柱的是 血紅蛋白一根據(jù)分離的原理不同分類(lèi)，層析法主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析等 凝膠過(guò)濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)與荷電量不同而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。一般講，柱層析加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量，體積應(yīng)低于 5%的床體積，對(duì)于分析性柱層析，一般不超過(guò)床體積的1%。四、名詞解釋分配系數(shù)

5、是指溶質(zhì)在相互接觸而互不相溶的兩種溶劑中的溶解達(dá)到平衡時(shí)（1分），該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比（1分）。分配系數(shù)是代表物質(zhì)種屬的特征常數(shù)，是層析法分離純化生物大分子的主要依據(jù)。在層析技術(shù)中，分配系數(shù)是指一種化合 TOC o 1-5 h z 物在固定相與流動(dòng)相中的分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比（2分）。K=CS/C m=物質(zhì)在固定相的濃度/物質(zhì)在流動(dòng)相的濃度（1分）Rf 值層析定性實(shí)驗(yàn)中，比移值（1分）Rf表示：Rf=原點(diǎn)至色斑中心的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離（3分）Rf值取決于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相的體積比。由于兩相體積比在同一實(shí)驗(yàn)條件下是常數(shù)，所以Rf值主要決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)分配系

6、數(shù)不同，Rf值也不同。對(duì)于某種給定的化合物而言，在標(biāo)準(zhǔn)條件下Rf是常數(shù)。（1分）分子篩利用具有一定孔徑的高分子聚合物制成的、主要用于分離分子量不同的混合物的實(shí)驗(yàn)材料和方法（3分）。如PAGE能使混合物按分子量由小到大依次分離（1分）；而凝膠層析則能使混合物按分子量由大到小先后依次分離（1分）。保留值（retention value ）是表示樣品各組分在層析柱中停留時(shí)間的長(zhǎng)短（保留時(shí)間）或組分流出時(shí)所需流動(dòng)相體積的大?。ūＡ趔w積）。理論塔板等效高度（height to a theoretical plate,HETP），當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)柱的一定高度，在離開(kāi)這段柱時(shí)，流動(dòng)相中某組分的平均濃度與固定相中

7、的平均濃度可以達(dá)到分配平衡，完成這一平衡所需要的柱長(zhǎng)稱(chēng)為理論塔 板等效高度，簡(jiǎn)稱(chēng)板高，以H表示。分離度（resolution ）層析分離效能的總指標(biāo)Rs的定義為：兩相鄰組份層析峰保留時(shí)間之差與兩峰基線(xiàn)寬度總和之半的比值，它可在層析圖中用下式計(jì)算而得：Rs= （t R2-tR1）/1/2 （W M+W） =2 / tR/ （Wb1+W）Rs定量地描述了混合物中相鄰兩組份在層析柱中的分離情況。柱效率：混合物被分離的程度 （1分）及單組分被洗脫的體積（1分）。一般用塔板數(shù)n表示（1分）。兩組分t r相差越大、峰寬W越小、塔板數(shù)n越大、平衡次數(shù)越多，柱效率越高（1分）。組分被分離的程度（Rs）及單組分

8、被洗脫的體積（ WboRs越大，Wb越小，柱效越高?？捎美碚撍鍞?shù)n或有效理論塔板數(shù)和有效理論塔板高度來(lái)衡量柱效能的高低。對(duì)一定的柱長(zhǎng)L而言，每達(dá)成一次分配平衡所需的理論塔板高度H愈小，理論塔板數(shù)n愈大，柱效能就愈高。當(dāng)tR2-tR1的值越大（即兩組份的保留值差距越大），Rs值越大，表示出兩峰分得越開(kāi)，柱分離效能越高，反映了層析作用中的熱力學(xué)過(guò)程當(dāng)兩峰的峰寬總和越小 （即兩峰越窄），Rs值亦越大，兩組份分離越好，越集中，表示柱分離效能越高，反映了層析作用中的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。理論塔板數(shù)n塔板理論把層析柱比擬成一個(gè)分儲(chǔ)塔，由許多塔板組成。在每個(gè)塔板上，組分在兩相間達(dá)成一次平衡。理論塔板數(shù)n就是指物質(zhì)在

9、柱長(zhǎng)L的層析柱中可以達(dá)成的平衡次數(shù)。對(duì)一定的柱長(zhǎng)L而言，每達(dá)成一次分配平衡所需的理論塔板高度H愈小，理論塔板數(shù)n愈大，柱效能就愈高，所以，可用理論塔板數(shù)n來(lái)描述柱的分離效能。n=L/H五、簡(jiǎn)述題DEAE千維素離子交換層析分離血清混合蛋白質(zhì)時(shí)，采用梯度洗脫法有何優(yōu)點(diǎn)？為什么pH要由高低到低變化而離子強(qiáng)度要由低到高變化？答：DEAE纖維素離子交換層析分離血清混合蛋白質(zhì)時(shí)，采用梯度洗脫法有如下優(yōu)點(diǎn)：梯度洗脫，使洗脫能力持續(xù)增強(qiáng)（1分），適用于Dm值相近的各組分的分離（1分）。血清混合蛋白pl有的比較接近，與交換劑親和力相近（1分），采用梯度洗脫法可以提高分離效果（1分）。（2） pH由高低到低變化，

10、正好能使血清蛋白按pl由高到低依次失去電荷（1分）、分子量由大到小相繼被洗脫（1分）。（3）離子強(qiáng)度由低到高變化，使競(jìng)爭(zhēng)性與離子交換劑結(jié)合的能力逐步增強(qiáng)（1分），洗脫能力逐步增強(qiáng)，從而使結(jié)合到柱上的血清蛋白能按結(jié)合力由弱到強(qiáng)逐步被洗脫。（1分）如果pH由低到高、pl由高低到低變化，所有蛋白質(zhì)全部被一次性洗脫（1分），達(dá)不到分離的目的（1分）。簡(jiǎn)述離子交換層析的的原理，并舉例說(shuō)明其在蛋白質(zhì)分離純化中的具體應(yīng)用。答：離子交換層析是以離子交換劑為固定相。利用其對(duì)需要分離的各種離子結(jié)合力的差異而將混合物中的不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)（2分）。離子交換劑是一類(lèi)具有特殊網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的高分子多元酸或多元堿的

11、聚合物，不溶于水和許多有機(jī)溶劑。聚合顆粒中帶電荷的酸性或堿性基團(tuán)作離子交換基團(tuán)，通過(guò)靜電作用與帶相反電荷的離子（反離子）結(jié)合。當(dāng)流動(dòng)相中存在其帶它相反電荷的離子時(shí)，就與先結(jié)合在固定相交換基閉上的反離子進(jìn)行交換（1分）。根據(jù)可交換離子的性質(zhì)，離子交換劑分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑兩大類(lèi)。陽(yáng)離子交換劑分子中具有酸性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陽(yáng)離子進(jìn)行交換。例：R-SQ -H+Na+- R-S0 3-Na+H （1 分）陰離子交換劑分子中具有堿性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陰離子進(jìn)行交換。如：R -CH） 30H +CIR- N + （ CH） 3 甲-+0H （1 分）流動(dòng)相中，不同離子化合物帶電荷多少不同，

12、與離子交換劑相互作用的強(qiáng)弱也不同，當(dāng)它們被結(jié)合到固定相交換基團(tuán)上后，可以用提高流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度或改變pH的辦法，把它們從離子交換柱上依次洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的日的（1分）。二乙氨基乙基纖維素 （DEAE-纖維素）常用來(lái)分離中性或酸性蛋白質(zhì)。例如：將血清蛋白質(zhì)加到DEAE纖維素（二乙氨基乙基纖維素，Diethylaminoethyl Cellulose,簡(jiǎn)稱(chēng)：DEAE纖維素）離子交換層析柱上，蛋白質(zhì)分子可與離子交換纖維素之間以離子鍵結(jié)合，其結(jié)合能力的大小主要決定于蛋白質(zhì)分子所帶的電荷量（1分）。由于血清各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，因而其荷電量不同，與纖維素結(jié)合的能力也不同（1分）。應(yīng)用梯度洗脫法

13、，逐漸改變洗脫液的pH,使吸附在離子交換纖維素上的蛋白質(zhì)依次失去電荷（1分），并且通過(guò)逐步增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度使加入的離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)纖維素上的電荷位置( 1 分)，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成,從而使血清中的蛋白質(zhì)分成Y -球蛋白、a-和3-球蛋白、清蛋白幾個(gè)部分被洗脫下來(lái)，以達(dá)到分離純化。1 分)3.有一蛋白質(zhì)混合物，分子量相近，等電點(diǎn)分別為：A=9.7 ; B= 6.8 ; C= 4.5 ; D= 8.5 ; E= 7.0 ，在高 pH 時(shí)加到4.5.DEAE 纖維素離子交換柱上。如果用逐步降低洗脫液明理由試列舉出三種層析方法，比較其原理和應(yīng)用范圍。試述離子交換層析法分離血清蛋白質(zhì)的基本原理

14、。pH 的方法來(lái)進(jìn)行洗脫，請(qǐng)指出各蛋白質(zhì)的洗脫順序，并說(shuō)如果將血清蛋白質(zhì)在高pH 時(shí)加到 DEAE 纖維素離子交換柱上，(白蛋白pl是4.0、a球用逐步降低洗脫液pH 的方法來(lái)進(jìn)行洗脫，請(qǐng)指出各蛋白質(zhì)的洗脫順序，并說(shuō)明理由。蛋白pl是4.8? 5.06、B球蛋白pl是5.4、Y球蛋白Pl是7.1。)凝膠層析有哪些應(yīng)用？ 凝膠層析技術(shù)的應(yīng)用：(1 ) 作為分析工具： 分子量相差比較大的混合物可以用凝膠層析進(jìn)行分析。在凝膠層析的基礎(chǔ)上配合使用紙層析或薄層層析技術(shù)可以鑒別 出各個(gè)析離成分。作為脫鹽工具：高分子 (如蛋白質(zhì)核酸、多糖等) 溶液中的鹽類(lèi)雜質(zhì)可以借助凝膠層析技術(shù)將其除去，這一操作稱(chēng)為脫鹽，凝膠層析技術(shù)脫鹽速度快而完全，而且蛋白質(zhì)、酶類(lèi)等成分在分離過(guò)程不易變性。葡聚糖凝膠 SephadexG-25 因流動(dòng)阻力小交聯(lián)度適宜，常用于蛋白質(zhì)溶液的脫鹽。高分子溶液的濃縮：用于去除熱原物質(zhì)：熱原物質(zhì)是微生物產(chǎn)生的某些使人發(fā)熱的物質(zhì)，如某些多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物等，用凝膠處理去離子水，可以得到適于制備注射劑的無(wú)熱原質(zhì)水。用于測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量 用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品放入同一凝膠層析柱內(nèi)，令其在同一條件下進(jìn)行凝膠層析分離，記下每一種成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)，可得一直線(xiàn)這就是分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。用于物質(zhì)的分離提純?cè)嚪謩e闡述分配層析和吸附層析法分離鑒定