分析方法驗(yàn)證課件

1、液相色譜法方法驗(yàn)證島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司分析儀器事業(yè)部 分析中心為什么要進(jìn)行方法驗(yàn)證？方法驗(yàn)證的目的 判斷該方法是否科學(xué)、合理，是否能有效控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。方法驗(yàn)證的流程 方法開(kāi)發(fā)法規(guī)規(guī)定需要進(jìn)行考察的內(nèi)容制定驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(Validation Plan)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)匯總和處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，填寫(xiě)驗(yàn)證報(bào)告。由質(zhì)量負(fù)責(zé)人審批通過(guò)后以質(zhì)量管理文件形式保存定期回顧，如有變更，確認(rèn)是否需要進(jìn)行再驗(yàn)證和如何進(jìn)行再驗(yàn)證為什么要進(jìn)行方法驗(yàn)證？方法驗(yàn)證的意義 藥品的生產(chǎn)過(guò)程中，原料、中間體、成品均需進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果既是過(guò)程受控的依據(jù)，也是評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的重要依據(jù)，檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確可靠。而分析方法的

2、驗(yàn)證為檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性提供了可靠保證。 方法驗(yàn)證可以分成兩種類型： 1）藥典或注冊(cè)分析方法的驗(yàn)證 2）非藥典或注冊(cè)分析方法的驗(yàn)證 （一般為企業(yè)針對(duì)自身的產(chǎn)品而自行開(kāi)發(fā)的方法）相關(guān)法規(guī)ICH （用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)）相關(guān)法規(guī) ICH Q2（R1）、Q2A、Q2B藥典 各國(guó)藥典對(duì)分析方法驗(yàn)證均有具體的規(guī)定。 2010版中國(guó)藥典附錄 XIX A 藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則 USP Validation of compendia methodsFDA相關(guān)法規(guī) 色譜方法驗(yàn)證審評(píng)指南驗(yàn)證方法開(kāi)發(fā)和方法驗(yàn)證的關(guān)系方法開(kāi)發(fā)是實(shí)現(xiàn)方法驗(yàn)證的先行步驟 方法驗(yàn)證是檢驗(yàn)方法開(kāi)發(fā)是否成功的依據(jù) 方

3、法開(kāi)發(fā)階段仍需要進(jìn)行部分的方法驗(yàn)證的內(nèi)容 - 如：考察保留時(shí)間的重現(xiàn)性方法開(kāi)發(fā)與方法驗(yàn)證的關(guān)系圖 方法開(kāi)發(fā)方法驗(yàn)證方法適用方法不適用驗(yàn)證不通過(guò)驗(yàn)證通過(guò)重新進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)，并檢討方法開(kāi)發(fā)流程確定為SOP方法驗(yàn)證的前提條件儀器：儀器設(shè)備經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和校正，且在有效期內(nèi)人員：經(jīng)過(guò)充分的培訓(xùn)，熟悉方法以及所使用的儀器物料：使用符合相關(guān)規(guī)定的物料（包括標(biāo)準(zhǔn)品、試劑、容器等）方法：該分析方法的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化已經(jīng)成功完成，并且已經(jīng)考察其耐用性。環(huán)境：試驗(yàn)環(huán)境符合該分析方法的要求。（潔凈度、溫度、濕度等）方法驗(yàn)證計(jì)劃如何制定？不同的分析方法對(duì)驗(yàn)證項(xiàng)目的要求：驗(yàn)證項(xiàng)目鑒別雜質(zhì)定性雜質(zhì)定量測(cè)定含量溶出度等準(zhǔn)確度-+精密度重

4、復(fù)性-+精密度中間精密度-+專屬性+檢測(cè)限-+-定量限-+-線性-+范圍-+耐用性+準(zhǔn)確度（Accuracy）準(zhǔn)確度，是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度；表示分析方法的正確性。由于“真實(shí)值”無(wú)法準(zhǔn)確知道，因此，通常采用回收率（%）來(lái)表示。涉及到定量測(cè)定的檢測(cè)項(xiàng)目均需驗(yàn)證準(zhǔn)確度，如雜質(zhì)定量檢查，含量和溶出方法，分析方法的準(zhǔn)確度能夠確保： 1） 樣品中的待測(cè)物全部溶解 2） 待測(cè)物全部從檢測(cè)器中檢出 回收率（Recovery）測(cè)定回收率R的具體方法可采用： “回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”回收試驗(yàn) 空白+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M 加樣回收試驗(yàn) 已準(zhǔn)確測(cè)定含量P的

5、真實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M回收率（Recovery）對(duì)于檢測(cè)的禁用物質(zhì)，回收率應(yīng)在方法測(cè)定低限、兩倍方法測(cè)定低限和十倍方法測(cè)定低限進(jìn)行三水平試驗(yàn)（n=3）；對(duì)于已制定最高殘留量（MRL）的樣品，回收率應(yīng)在方法測(cè)定低限、MRL、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)；在加樣回率收試驗(yàn)中須注意標(biāo)準(zhǔn)品的加入量與樣品被測(cè)組分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)；應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率 ( ) 計(jì)算值，以及回收率 ( ) 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)回收率（Recovery）準(zhǔn)確度的接受標(biāo)準(zhǔn)1）含量和溶出： a）各濃度下的平均回收率應(yīng)在98.0%-1

6、02.0%之間 b）9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)不大于2.0% c）中藥檢品一般應(yīng)滿足：回收率計(jì)算值在95%-105%范圍2）雜質(zhì)雜質(zhì)含量水平接受標(biāo)準(zhǔn)0.2%絕對(duì)值0.05%0.2% - 1.0%相對(duì)值20%1.0%相對(duì)值10%指在規(guī)定測(cè)試條件下，同一均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間接近的程度。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) （變異系數(shù)，CV）表示。精密度（Precision）重復(fù)性（Repeatability） 是指在同一條件下對(duì)同一批樣品，從樣品液制備開(kāi)始，制備至少六份以上供試品溶液(即 n 6), 或設(shè)計(jì) 3 個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制備 3 份

7、供試溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。接受標(biāo)準(zhǔn)：原料藥方法驗(yàn)證時(shí)，活性成分的 RSD 1.0%；制劑方法驗(yàn)證時(shí)，活性成分峰 RSD 2.0%；雜質(zhì)方法驗(yàn)證是，每個(gè)雜質(zhì)峰 RSD 20%；中間精密度（ Intermediate Precision ） 同一批樣品每位分析人員準(zhǔn)備六份進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算兩人之間平均值的差異。 接受標(biāo)準(zhǔn)：原料藥方法驗(yàn)證時(shí)，平行六份樣品的 RSD 1.0%，兩人之間的 平均值之差 1.0% ；制劑方法驗(yàn)證時(shí)，平行六份樣品的 RSD 2.0%，兩人之間的 平均值之差 3.0% ；雜質(zhì)方法驗(yàn)證是，平行六份樣品的 RSD 20%，兩人之間的平均值之差如下表：

8、雜質(zhì)含量水平接受標(biāo)準(zhǔn) 0.2%絕對(duì)值0.05%0.2% - 1.0%相對(duì)值20%1.0%相對(duì)值10%準(zhǔn)確度和精密度關(guān)系A(chǔ) 準(zhǔn)確度好，精密度好B 準(zhǔn)確度差，精密度好C 準(zhǔn)確度好，精密度差D 準(zhǔn)確度差，精密度差 指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能夠正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性通常，鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法中均應(yīng)考察其專屬性。如果采用的方法專屬性欠佳，應(yīng)采用多個(gè)方法予以補(bǔ)充。專屬性（ Specificity ）檢測(cè)限（limit of detection，LOD） 檢測(cè)限，是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限是一種限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，即反映方法與儀器的靈敏度

9、和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白 ( 本底 ) 值的高低。 可用已知低濃度樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以 S / N 3 時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。檢測(cè)限的報(bào)告數(shù)據(jù)應(yīng)附圖譜， 說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。 定量限（1imit of quantitation，LOQ）定量限，是指在保證一定準(zhǔn)確度和精密度的前提下，樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量。常用信噪比法測(cè)定定量限。一般以 S / N 10 時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定。也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。應(yīng)附典型圖譜線性（lin

10、earity）線性，在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系的程度。 線性是定量測(cè)定的基礎(chǔ)，涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，均需要驗(yàn)證其線性。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系。可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，制備一系列供試品的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)濃度（通常選擇50%、80%、100%、120%、150%）。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)被測(cè)物濃度作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸?；貧w方程的相關(guān)系數(shù) r 越接近于1，表明線性關(guān)系越好。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，并說(shuō)明依據(jù)。線性的接受標(biāo)準(zhǔn) 含量類型相關(guān)系數(shù)截距含量方法R 0.9997，或 R2 0.9992.0%定量雜質(zhì)方法R 0.995，或

11、 R2 0.99020%范圍范圍指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。雜質(zhì)定量檢查、含量和溶出方法均應(yīng)驗(yàn)證其范圍，分析方法 的范圍應(yīng)根據(jù)具體分析方法以及對(duì)線性、準(zhǔn)確度、精密度的結(jié)果和要求確定。范圍通常用于分析方法測(cè)試結(jié)果相同的單位（如百分濃度）表達(dá)。涉及到定量測(cè)定的檢測(cè)項(xiàng)目均需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，如含量測(cè)定、含量均勻度、溶出度、雜質(zhì)定量試驗(yàn)等。范圍的接受標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于半成品或者成品含量測(cè)試，范圍通常為測(cè)試濃度的80% -120%。對(duì)于雜質(zhì)測(cè)試，范圍為測(cè)試濃度的50% -120%。對(duì)于含量均勻度測(cè)試，除了基于劑型本身特點(diǎn)而確定的更寬的范圍外，范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的70% -1

12、30%。對(duì)于溶出度測(cè)試，范圍應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍的20%。耐用性耐用性指測(cè)定條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，主要考察方法本身對(duì)可變?cè)囼?yàn)因素的抗干擾能力。開(kāi)始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)試條件要求苛刻，則建議在方法中予以說(shuō)明。典型的變動(dòng)因素在液相色譜法中，典型的變動(dòng)因素包括：流動(dòng)相的組成流速流動(dòng)相的pH值不同廠家或者不同批號(hào)的同類色譜柱色譜柱操作溫度被測(cè)溶液的穩(wěn)定性，樣品的提取次數(shù)、時(shí)間等耐用性在評(píng)估參數(shù)是需要獲得改變條件后與標(biāo)準(zhǔn)條件下的測(cè)量結(jié)果，通過(guò)對(duì)改變條件后與標(biāo)準(zhǔn)條件下結(jié)果的比較來(lái)評(píng)估方法的耐用性。改變條件后與標(biāo)準(zhǔn)條件下結(jié)果的差異計(jì)算公式如下： %Differenc

13、e = 100 -100 Rm / Rs 其中， Rm - 改變條件后的含量結(jié)果， Rs - 標(biāo)準(zhǔn)條件獲得的含量結(jié)果。典型例子耐用性參數(shù)實(shí)驗(yàn)描述通用認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制變化參數(shù)1） 流動(dòng)相pH0.2單位；2） 緩沖溶液濃度：規(guī)定濃度的90%-110%；3） 有機(jī)相比例相對(duì)變化1% (請(qǐng)使用預(yù)混合的流動(dòng)相)比較標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果和改變方法后得到的結(jié)果，如果沒(méi)有影響，則認(rèn)為方法有耐用性；否者對(duì)應(yīng)的參數(shù)必須在系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試中進(jìn)行考察可選擇變化參數(shù)以下方法參數(shù)在給定范圍內(nèi)變化：1） 相對(duì)規(guī)定提取時(shí)間的15%范圍2） 超聲時(shí)間（5，10，20分鐘）3） 相對(duì)規(guī)定柱溫的5范圍4） 不同供應(yīng)商的色譜柱5） 不同生產(chǎn)批次

14、的色譜柱6） 不同的QC實(shí)驗(yàn)室典型例子耐用性參數(shù)實(shí)驗(yàn)描述認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)所測(cè)組分含量 97.0 %時(shí)，% Difference 1.0 %樣品溶液穩(wěn)定性1） 樣品溶液在放置4/8/12/24小時(shí)或者更長(zhǎng)的時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)2）樣品溶液在室溫保存下和低溫保存的條件下存放一定時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)所測(cè)組分含量 97.0 %時(shí)，% Difference 2.0 %所測(cè)組分含量 10 %時(shí)，% Difference 5.0 %耐用性的接受標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于原料藥和制劑： 主要成分的含量差異不得大于1.5%對(duì)于雜質(zhì)測(cè)試，接受標(biāo)準(zhǔn)如下：雜質(zhì)水平接受標(biāo)準(zhǔn) 0.2%絕對(duì)值 0.05%0.2% - 1.0%相對(duì)值 20%1.0 %相對(duì)值 1

15、0%方法再驗(yàn)證方法再驗(yàn)證的定義：原料、工藝、處方、分析方法發(fā)生部分改變時(shí)，對(duì)分析方法再次進(jìn)行全面或者部分驗(yàn)證，以保證分析方法可靠，這一過(guò)程稱為方法再驗(yàn)證。方法再驗(yàn)證原則：根據(jù)改變的程度進(jìn)行相應(yīng)的再驗(yàn)證。實(shí)際應(yīng)用例子變更內(nèi)容可能存在的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)需驗(yàn)證的項(xiàng)目原料藥合成工藝變更產(chǎn)生新的雜質(zhì)，影響測(cè)定結(jié)果雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法制劑處方改變，輔料變更影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測(cè)定的準(zhǔn)確度鑒別、含量測(cè)定方法原料來(lái)源變更影響雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定的專屬性和準(zhǔn)確度雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法某一分析方法改變（如檢測(cè)波長(zhǎng)改變）方法修訂不合理，影響該項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果該方法全面驗(yàn)證實(shí)際應(yīng)用例子變更內(nèi)容可能存在的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)需驗(yàn)證的項(xiàng)目原料藥合成工藝變更產(chǎn)生新的雜質(zhì)，影響測(cè)定結(jié)果雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法制劑處方改變，輔料變更影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測(cè)定的準(zhǔn)確度鑒別、含量測(cè)定方法原料來(lái)源變更影響雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定的專屬性和準(zhǔn)確度雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法某一分析方法改變（如檢測(cè)波長(zhǎng)改變）方法修訂不合理，影響該項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果該方法全面驗(yàn)證方法再驗(yàn)證 方法再驗(yàn)證是對(duì)分析方法的完善過(guò)程,應(yīng)根據(jù)實(shí)際改變情況進(jìn)行再驗(yàn)證,從而保證所采用的分析方法能夠控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。 方法再驗(yàn)證的目的 判斷變更發(fā)生后，對(duì)應(yīng)的分析法方法是否科學(xué)、