ELISA的基本原理1課件

1、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 重慶市疾病預(yù)防控制中心 彭靖堯背景免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)原理：利用抗原抗體反應(yīng)的原理，于抗原或抗體上加載各種標(biāo)志物，抗原抗體反應(yīng)中加入標(biāo)志物示蹤，利用標(biāo)志物的可測量性來達(dá)到快速、敏感地檢測各種體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)。特點(diǎn)：特異性、專一性、高效性。發(fā)展1941年 Coons建立熒光抗體技術(shù)1959年 Yalow 和Berson創(chuàng)建放射免疫分析1971年 Engvall和Perlaman以及Weeman和Schuur 用酶代替放射性核素制備了酶標(biāo)記物，創(chuàng)立了酶免疫分析技術(shù)固相載體與抗原抗體易于結(jié)合，結(jié)合穩(wěn)定不易脫落能

2、結(jié)合抗原抗體免疫反應(yīng)復(fù)合物固相化后保持活性（活性基團(tuán)朝向反應(yīng)液）固相化方法簡便易行酶和底物酶催化活性高、低濃度高效率能與抗原（體）共價(jià)交聯(lián)，穩(wěn)定且不影響免疫反應(yīng)活性催化底物產(chǎn)生有色信號(hào)易于測量、重復(fù)性好酶活性不易受影響、穩(wěn)定（可較長時(shí)間保存）、對(duì)人體無害常用有HRP和AP試劑條件的選擇主要是最佳工作濃度的選擇防止本底高、靈敏度低常用棋盤法酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA是在酶免疫技術(shù)上發(fā)展起來的固相酶免疫測定抗原（抗體）結(jié)合到固相載體表面標(biāo)本和酶標(biāo)抗體（抗原）與固相上抗原（抗體）反應(yīng)洗滌、加酶反應(yīng)底物，通過被酶催化產(chǎn)生的顏色及吸光度值定性、定量ELISA的基本原理抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表

3、面后，仍然能保持其免疫學(xué)活性而能相互特異性結(jié)合?？乖贵w復(fù)合物與酶標(biāo)的二抗結(jié)合，加入合適的底物在酶的作用下顯色，顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關(guān)系，可進(jìn)行定性和定量分析。ELISA的種類檢測抗原：競爭法 ELISA標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中的抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，顯色越淺。將特異性抗體包被于固相載體表面，洗滌后分為兩組，一組加入酶標(biāo)抗原和被測抗原的混合液，另一組只加入酶標(biāo)抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，兩組吸光度之差就是所測定未知抗原的量。 包被特異性抗體 酶標(biāo)抗原檢測抗原孵育洗滌后顯色加樣AB競爭法ELISA3.顯色3.孵育1.加樣特點(diǎn)酶標(biāo)抗

4、原（抗體）與樣本中的非標(biāo)記抗原（抗體）具有相同的與固相抗體（抗原）結(jié)合的能力固相抗體（抗原）和酶標(biāo)抗原（抗體）固定限量，且前者集結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)和非標(biāo)的分子數(shù)量和反應(yīng)好后，固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原（抗體）量與樣品中的非標(biāo)記的抗原（抗體）濃度成反比主要用于小分子抗原或半抗原的定量測定，也可對(duì)抗體進(jìn)行測定。檢測抗原：雙抗體夾心法ELISA 將特異性抗體包被于固相載體表面，與標(biāo)本中相應(yīng)抗原相結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的第二特異性抗體與抗原結(jié)合，加入底物后顯色。包被特異性抗體雙抗體夾心法ELISA檢測抗原1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色酶標(biāo)特異性抗體檢測抗體：間接法ELISA（Indire

5、ct ELISA）將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗人IgG或IgM抗體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色間接法ELISA檢測抗體：捕獲法ELISA（Capture ELISA）專門用來檢測IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面，與標(biāo)本中所有人IgM抗體結(jié)合，洗滌后加入特異性抗原與相應(yīng)的特異性IgM抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗原特異性抗體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.顯色捕獲法ELISA檢測抗體：雙抗原夾心法ELISA檢測標(biāo)

6、本中的總抗體（包括IgM和IgG型抗體） 。將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中特異性IgM和IgG型抗體結(jié)合，洗滌后加入酶標(biāo)的特異性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。3.洗滌1.加樣2.孵育6.顯色5.孵育4.加入酶標(biāo)抗原雙抗原夾心法ELISAELISA試劑的組成固相載體：許多物質(zhì)可以作為固相載體，如纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最為常用的是聚苯乙烯材質(zhì)的微孔板，多為8 12道96孔板條。 吸附能力 通透性 均一性底物：不同種類的酶要求使用不同的底物。HRP鄰苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD） 、四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylb

7、enzidine，TMB）和ABTS 2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)，OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便，作用后變橙紅色，其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍(lán)色，目測對(duì)比鮮明，加酸停止酶反應(yīng)后變黃色。AP對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。 洗滌液：聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗滌時(shí)應(yīng)非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，應(yīng)嚴(yán)格按

8、要求洗滌。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，一般是吐溫20（聚山梨酯 ）。洗板時(shí)注意不同試劑盒的洗液不要混用。標(biāo)本稀釋液：用來稀釋血清標(biāo)本，有時(shí)也稀釋酶結(jié)合物。RF吸附劑：在進(jìn)行IgM抗體檢測時(shí)，間接ELISA方法需要使用RF吸附劑去除類風(fēng)濕因子的干擾作用。結(jié)果判斷S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標(biāo)本)的簡寫，表示的是標(biāo)本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑制法外，其它ELISA定性測定模式中，當(dāng)S/CO值大于或等于1時(shí)，標(biāo)本的測定為陽性，小于1時(shí)為陰性。S/N或P/N：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標(biāo)本)的簡寫，N為Nega

9、tive(陰性對(duì)照)的簡寫，P為Patient（患者）的簡寫。較早的試劑盒很多都使用S/N或 P/N2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區(qū)別，只不過是前者將陰性對(duì)照（N）的2.1倍視為Cut -off值而已 。注意事項(xiàng)臨床標(biāo)本的收集和保存ELISA測定中試劑準(zhǔn)備加血清樣本反應(yīng)試劑溫育的時(shí)間與溫度ELISA測定的洗版顯色比色結(jié)果的判定ELISA的操作要點(diǎn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。檢測麻疹/風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體方法介紹間接法血清預(yù)處理ELISA間接法使用RF吸附劑 類風(fēng)濕因子

10、（10）是一種自身抗體，主要有IgM組成，能與抗原抗體復(fù)合物的FC段結(jié)合，非特異性IgM抗體（風(fēng)濕因子）的存在將導(dǎo)致IgM檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果。麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM抗人酶標(biāo)IgM抗體類風(fēng)濕因子陽性結(jié)果假陽性結(jié)果 另外，也存在弱結(jié)合的病原體特異性IgM抗體被強(qiáng)結(jié)合的IgG抗體取代的可能性。在這種情況下，IgM的檢測將得到假陰性的結(jié)果。麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM酶標(biāo)抗人IgM抗體陽性結(jié)果假陰性結(jié)果 因此，在進(jìn)行IgM檢測前應(yīng)用類風(fēng)濕因子吸附劑對(duì)血清作預(yù)處理;對(duì)IgG用A蛋白和抗 IgG抗體處理。 捕獲法抗人IgM抗體非特異性捕獲病毒抗原酶標(biāo)抗體（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固

11、相抗人IgM.（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。 （3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。 （4）加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。 （5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應(yīng)。標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和保存Relative levels of antibody IgM sensitivity 70%071421283542-7-14-210246810RashonsetDays after rash onsetIgGIgMInfectionvirus excretion用于IgM抗體檢測的血清標(biāo)本要在初次接觸病人時(shí)馬上采集，以及出疹后28天內(nèi)采集用于病毒分離的標(biāo)本,需出疹天內(nèi)采集咽拭子或尿液麻疹病毒感染體液免疫過程必要日期:最后接種日期出疹日期出生日期血清分裝：必須使用血清保存管儲(chǔ)存血清，2 ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫。標(biāo)本登記:實(shí)驗(yàn)室在收到送檢標(biāo)本后，