食源性病原菌分子分型

1、食源性病原菌分子分型內(nèi)容安排12月23日 食源性病原菌基因組模板的提取12月30日 食源性病原菌分子鑒定1月6日 食源性病原菌分子分型 10403S（強毒株）：720bp iap + 403bp lmo0038 H4 （弱毒株）： 720bp iap 一. 意義如果某地在食品衛(wèi)生監(jiān)督中發(fā)現(xiàn)有些食品中被李斯特菌污染，而在此前后，另一些地區(qū)發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染病人持續(xù)增加，那么這兩者之間有無聯(lián)系？如何證明？這在過去確實是個十分棘手的工作，因為食源性細菌種類繁多復雜，如果要比較不同來源的兩個或多個菌株是否是相同的菌株，必須進行極其繁雜、耗時耗力的分類鑒定和對照。SalmonellaE. coli O15

2、7:H7* Listeria monocytogenes* Vibrio parahaemolyticus30%0.38%0.005-0.01%四大食源性病原菌近年來，已經(jīng)開發(fā)了很多細菌分型方法，使細菌鑒定更加簡便快捷。例如：血清學分型、PCR技術等。而近年發(fā)展起來的脈沖場凝膠電泳，則是細菌分型的最靈敏的方法，已多次成功用于識別特異性致病菌，追溯食源性疾病爆發(fā)的來源，并確定不同地區(qū)時間爆發(fā)的食源性疾病之間的關聯(lián)性。 一. 意義傳統(tǒng)表型分析法 血清分型、噬菌體分型、多區(qū)帶酶電泳 分型、酯酶分型 分子(或DNA)分型法 脈沖場凝膠電泳分型 （PFGE） 基于DNA序列的分型技術 核糖體分型 （ri

3、botyping ） 基于PCR的分型技術 二. 分型方法1. 脈沖場凝膠電泳分型（PFGE）PFGE通過選擇特定的限制性內(nèi)切酶，將細菌DNA切成8-25條大小為40-600 kb的條帶，然后通過不斷變換電流方向，使各條帶得到較好的分離 。 可用于分離分子量范圍在120 Mb的線狀雙鏈DNA分子。當 DNA分子在電泳中朝一個方向移動時，DNA分子沿著電場的方向伸展開，這時，切斷電流，DNA則開始回復松弛的無規(guī)卷曲狀，松弛所需的時間取決于DNA分子的長度。分子越長，回復所需的時也越長。短時間后，一個新的電場加在與原來電場成一定角度的方向，長的DNA分子因還未回復到松弛狀態(tài)，需要更多的時間才能重新

4、開始朝新的電場方向移動。這樣，在這兩個方向上反復施加電場，就能使大分子量的DNA分子得到分離。PFGE原理PFGE程序細菌準備，裂解細胞（第一天）SE洗滌-TSE重懸至OD=0.9-溶菌酶-制樣品栓-蛋白酶K24h-平衡緩沖液限制性內(nèi)切酶酶切消化（第二天）新鮮配置限制性內(nèi)切酶酶切緩沖液-37水浴10-12 h電泳（染色、看結果）（第三天）加樣孔中電泳約24h-EB染色30min-UV light觀察拍照-BioNumerics分析PFGE分型重復性好，分辨率強； 方法在技術上較復雜，需要特殊的儀器以及操作時需要較長的時間，約需2-3天。 PFGE優(yōu)缺點目前，采用PFGE技術輔助食源性疾病的流行

5、病學分析，已獲得多次成功。例如：1998年美國多個地區(qū)發(fā)現(xiàn)阿貢納沙門氏菌感染。隨后，追溯到受感染的多個即食谷物制品，都來自同一家食品加工廠。先后對1000多個阿貢納沙門氏菌分離物進行了PFGE分型，確定了23個州的409個病例與該爆發(fā)相關。正是基于PFGE的巨大作用，美國疾病預防和控制中心（CDC）現(xiàn)已建立了分子分型網(wǎng)站PulseNet，采用共享的PFGE分型技術和成果，進行全國范圍的食源性疾病監(jiān)控。 PFGE應用單增李斯特菌食品及環(huán)境分離株的PFGE分型比較PFGE-based dendrogram demonstrating the genetic diversity of various

6、 L. monocytogenes strains2110073281056320p8NB001 33ScottA29p310403S HJ12681p6105760194690H401181P1P2P3P5P4P62. 核糖體分型The principle of ribotyping核糖體分型是利用Southern印跡分析來檢測與核糖操縱子有關的多態(tài)性。DNA由限制性內(nèi)切酶消化，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分開的限制性片段轉移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上，加上標記探針，這樣即可檢出含細菌rRNA基因的限制性片段。 3. 基于PCR的分型技術隨機擴增DNA多態(tài)性分析分型（RAPD）PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析分型（PCR-RFLP）擴增片段長度多態(tài)性分析分型（AFLP） 重復片段PCR分型（REP-PCR） 4. 多位點序列分析（MLST）對多個基因或基因片段進行測序來確定細菌的亞型及各分離株之間遺傳相關性的分型方法。與PFGE及核糖體分型相比，MLST結果明確而且便于解