分子生物實(shí)驗(yàn)課件：感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化

1、感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（二）結(jié)果感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化的原理; 熟悉實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟。 實(shí)驗(yàn)原理： 體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞才能大量的進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。 Cacl2法是目前實(shí)驗(yàn)室常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)菌處于零度、Cacl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細(xì)胞膜表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。轉(zhuǎn)化子的篩選1.抗生素篩選法：AMP抗性2.藍(lán)白斑篩選法：當(dāng)菌體中含有帶lacz的質(zhì)粒后，質(zhì)粒lacz基因編碼的肽鏈

2、和菌株基因組表達(dá)的端缺陷的-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具有與完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍(lán)色物質(zhì)的能力，這種現(xiàn)象即-互補(bǔ)。 用于藍(lán)白斑篩選的載體具有一段稱為lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子；編碼肽鏈的區(qū)段；一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)。MCS位于編碼肽鏈的區(qū)段中，是外源DNA 的選擇性插入位點(diǎn)，一旦有外源DNA插入到MCS中， lacz就發(fā)生插入突變，不能表達(dá)， X-gal將不能顯藍(lán)色，而形成白色菌落，肉眼可藉此分辨。實(shí)驗(yàn)步驟（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備均需在冰上操作 1. 取菌液1.5ml于Ep管中，冰浴10min后，4離心， 4000rpm,10min,去上清液，收集

3、菌體。 2. 將0.5ml預(yù)冷的0.1mol L Cacl2輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴15min。 3. 4離心， 4000rpm,10min。 4. 棄上清，加入50ul預(yù)冷的0.1mol L Cacl2，小心懸浮細(xì)胞。 5. 將制備好的感受態(tài)細(xì)胞放冰上進(jìn)行下一步試驗(yàn)。（二） 感受態(tài)轉(zhuǎn)化鑒定 1. 在上述Ep管中加入10ul連接反應(yīng)液，溫和混勻（輕度搖晃），于冰上放置30min(Ep管和移液器槍頭要提前預(yù)冷）。 2. 將上述混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)熱到42的水浴鍋中，熱休克90s，然后將Ep管迅速轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻3min. 3. 向管內(nèi)加入400ul的LB培養(yǎng)液，然后37100rpm振蕩培養(yǎng)45min。 4. 取100ul的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有Amp抗生素、IPTG和X-gal的L