分子生物實(shí)驗(yàn)課件：2 DNA的限制性酶切膠回收與連接

1、DNA的限制性酶切膠回收與連接掌握限制性內(nèi)切酶特異性切割DNA的原理與方法掌握DNA片段從瓊脂糖凝膠中回收的原理與方法掌握如何構(gòu)建體外重組DNA分子及DNA的連接方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康腄NA的限制性酶切反應(yīng)的原理 限制性內(nèi)切酶（restriction enzyme) 是一類識(shí)別DNA上特異核苷酸序列并產(chǎn)生切割反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶(endonuclease)的總稱。它能夠識(shí)別并結(jié)合雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列，在該序列內(nèi)部水解核苷酸之間的3,5-磷酸二酯鍵，切斷DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。限制性內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列一般長(zhǎng)度為46個(gè)核苷酸，具有回文結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA中含有的二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列，或稱為反向重復(fù)序

2、列 ）特征。在我們今天的實(shí)驗(yàn)中，用到兩種限制性酶分別是Hind和EcoR，這兩種酶切割后產(chǎn)生的片段都具有粘性末端，可以保證酶切產(chǎn)物與載體正確的連接。HindEcoR反應(yīng)緩沖液：10M Buffer反應(yīng)緩沖液：10H Buffer在兩者同時(shí)進(jìn)行酶切時(shí)，在M Buffer里時(shí)的效率最高。因此本實(shí)驗(yàn)中我們用M Buffer來進(jìn)行Hind和EcoR的雙酶切。酶切反應(yīng)體系（20ul） 質(zhì)粒DNA(sod-T vector) ：10ul 10M : 2ul Hind : 1ul EcoR: 1ul ddH2O : 6ul37水浴2h，加2ul 10 loading buffer終止酶切反應(yīng)，取全部的樣品用

3、于電泳。從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA在酶切的過程中，除產(chǎn)生我們所需要的目的片段外，還會(huì)產(chǎn)生一些非目的片段，這些片段可能會(huì)對(duì)連接反應(yīng)產(chǎn)生干擾，去除這些非目的片段的最好的方法就是進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收。瓊脂糖凝膠回收的原理：不同分子量的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳中泳動(dòng)速度不一樣而分離。NaI存在條件下，加熱至55，含有DNA片段的瓊脂糖凝膠就會(huì)融化，然后可利用硅膠樹脂吸附DNA分子，從而得到純凈的DNA片段。硅膠樹脂在高鹽離子濃度下可以高效專一的吸附DNA，通過離心可將DNA片段沉淀下來，在堿性低鹽濃度下其與DNA的結(jié)合能力會(huì)急劇降低，如使用弱堿溶液如TE(pH8.0)就可以從硅膠離心柱洗

4、脫得到純凈的DNA片段。取一干凈的1.5ml的EP管，稱重，做好標(biāo)記。紫外下用干凈的手術(shù)刀切下含有目的片段（600-700bp左右）的凝膠塊，放入已稱重的EP管中，再次稱重。按每100mg瓊脂糖凝膠塊：400ul Binding Solution的量，添加Binding Solution至裝有凝膠的離心管中。50-60放置5-10min融膠。期間可震蕩混勻數(shù)次，使凝膠充分融解。將上述混合液轉(zhuǎn)移至Genclean柱中，室溫放置2min，6000rpm室溫離心1min。將離心下來的液體倒回Genclean柱中再重復(fù)離心一次以提高回收效率。步驟：棄收集管中的廢液。往Genclean柱中加入500ul

5、 Wash Solution，12000rpm，1min，棄廢液。重復(fù)步驟5一次。將Genclean柱放回收集管中，12000rpm 離心1min，徹底去除Wash Solution。將Genclean柱放到一干凈的1.5ml的EP管中，加入30ul Elution Buffer，37 放置2min，12000rpm離心1min。步驟：溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故切膠時(shí)應(yīng)使用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈，切膠時(shí)間盡量短。切膠時(shí)，盡量沿目的片段邊緣切下，使其所帶的瓊脂糖盡量少。這樣瓊脂糖不會(huì)影響后面的提純。將目的DNA吸附在Genclean柱上，要重復(fù)回收一次，以提高目的DNA的回收效率。Wash Solution清洗Genclean柱兩次后，要再離心一次，以去除殘余的Wash Solution，避免影響后續(xù)TE洗脫目的DNA。注意事項(xiàng)：DNA的重組連接的原理DNA重組連接是通過將已經(jīng)切開的載體和外源DNA，通過DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段組鄰的5端磷酸與3端羥基之間形成磷酸酯鍵，從而形成新的DNA。本實(shí)驗(yàn)利用T4DNA連接酶，有Mg2+、ATP存在的連接反應(yīng)體系中，將載體puc18與目的基因sod連