實驗具體實施方案

1、課題設(shè)計（選題一：需1人完成）1、微生物的菌群隨季節(jié)的變化規(guī)律（參照不同栽培年限人參根區(qū)土壤微生 物區(qū)系變化和草原土壤微生物受放牧的影響及其季節(jié)變化）1.1材料2011年3月，毛烏素沙漠采集供試土壤樣品。采用5點取樣法采 集人參根區(qū)510 cm處土壤樣品，裝入無菌聚乙烯自封袋中，采回土樣即刻對 微生物進行分離、鑒定。1.2材料處理 采用稀釋平板法1-3 對真菌、細菌和放線菌進行分離和數(shù)量 測定。真菌的分離用馬丁氏或馬鈴薯培養(yǎng)基;細菌的分離用牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基;放線菌的分離用高氏號培養(yǎng)基+重銘酸鉀。準確稱取10 g已過篩土壤, 加入盛有90ml無菌水的三角瓶中，加入玻璃珠后用振蕩儀劇烈振蕩30

2、S,得 10-1 土壤懸濁液。充分渦旋后，立即吸取1m l懸濁液加入另一盛有9m l無菌水 的試管中，得10-2 土壤懸濁液。按上述方法依次將土壤稀釋成10-3, 10-4, 10-5和10-6的懸濁液。1.3 土壤微生物的分離、統(tǒng)計根據(jù)待分離的微生物類型，分別吸取不同稀釋倍數(shù)的土壤懸濁液（真菌 為10-3,放線菌為10-4,細菌為10-5）0.2m,l加入至預(yù)先制備好的平板培養(yǎng) 基，用無菌涂布器將土壤懸濁液均勻涂布在培養(yǎng)基上，每種處理設(shè)3次重復(fù)。 將培養(yǎng)基在特定溫度下恒溫培養(yǎng)數(shù)天后觀察、統(tǒng)計菌落數(shù)目。真菌培養(yǎng)溫 度為25C ,培養(yǎng)時間為67 d;放線菌培養(yǎng)溫度為28C ,培養(yǎng)時間為45 d;

3、細 菌培養(yǎng)溫度為30C ,培養(yǎng)時間為24 d。根據(jù)不同培養(yǎng)基中生長出的菌落數(shù) 統(tǒng)計真菌、細菌和放線菌數(shù)量結(jié)合土壤樣品的稀釋倍數(shù)，按照公式:土壤微 生物濃度（cfu/g） = （菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)）/每皿菌液加入量（ml）,求得土 壤中可培養(yǎng)真菌、細菌和放線菌濃度。統(tǒng)計結(jié)果用SPSS 18. 0進行顯著性 方差分析。1.4結(jié)果與討論：菌落總數(shù)的變化規(guī)律，做圖表。（選題二：需2人完成）微生物菌群隨時間的變化規(guī)律微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員。它們可以分為細菌、放線菌、 真菌、藻類和原生動物等。由于土壤類型、植物群落和氣候條件等因子的 影響，土壤微生物的分布類型和生理活性也存在著一定的差異。土壤

4、微生 物類群的特性和數(shù)量與土壤肥力和植物生長有密切關(guān)系。在土壤以及生物 圈的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中，土壤微生物起著關(guān)鍵作用。它們參于的主要 生態(tài)化學過程有：（1）有機化合物和動、植物及微生物殘體的分解；固氮 作用;腐殖質(zhì)的分解與形成；磷、硫、鐵及其它化學元素的轉(zhuǎn)化，以及碳、 氮、磷的生物地球化學循環(huán)等。在生態(tài)系統(tǒng)中，作為分解者的微生物，細 菌以占絕對優(yōu)勢的生物量起到重要作用，成為生物修復(fù)研究工作中的主要 對象。（2）微生物種群結(jié)構(gòu)與多樣性都是表征生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)的重要參 數(shù)，其對環(huán)境污染物的反應(yīng)表現(xiàn)為多種形式。有的表現(xiàn)為遺傳適應(yīng)，有的 表現(xiàn)為生理適應(yīng)，有的則表現(xiàn)為種群結(jié)構(gòu)的變遷，即以具抗性種取代

5、敏感 種。石油污染物進入土壤后對生態(tài)環(huán)境的影響首先表現(xiàn)為對土壤微生物的 影響，石油及其產(chǎn)品進入土壤能夠?qū)е峦寥牢⑸锓N群數(shù)量的改變、群落 結(jié)構(gòu)和組成的變化及群落多樣性的變化。有調(diào)查表明，石油污染地區(qū)土壤 中的嗜油微生物數(shù)量（細菌、放線菌、真菌）與對照土相比有不同程度的增 長。這是由于石油污水長期灌溉，使得土壤中形成了土著嗜油微生物區(qū)系， 其中微生物類群以細菌為主，細菌的生物量總是占絕對優(yōu)勢 （李寶明，2004）。國內(nèi)外許多學者應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)和前沿的分子生物學技 術(shù)對石油烴污染土壤中微生物的生態(tài)過程進行了大量的研究。這些研究的 大多數(shù)結(jié)論表明石油污染能夠?qū)е峦寥乐形⑸锒鄻有缘慕档?，?/p>

6、同種群 在數(shù)量上的變化，群落結(jié)構(gòu)和組成改變的同時石油烴降解菌群逐漸成為群 落中的優(yōu)勢菌群。在研究土壤石油烴污染對微生物影響的同時，也擴展了 對石油降解微生物的認識，發(fā)現(xiàn)了許多以前沒有發(fā)現(xiàn)的降解菌種（李慧，2005）。（二）實驗方案1營養(yǎng)液與含油廢水的配制用電子天平稱取NH4Cl 35g，KNO315.002g，K2HPO4 75.001g，NaH2PO4 28.302g,用量筒量取1000mL蒸餾水倒入1000mL的燒杯中，將稱好的成分加 入燒杯中，用玻璃棒攪拌使其溶解，得到標準營養(yǎng)液，最后移入1000mL容 量瓶中備用。將馬嶺和華慶標準原油分別取0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10、

7、20、40、80g分別溶在200ml無菌水和200ml營養(yǎng)液中配制成0.1%、0.2%、0.5%、 1%、2%、5%、10%、20%、40%的含油廢水，用于自然條件下和營養(yǎng)條件下土 壤添加碳源所用。2 土壤樣品添加碳源選取隴東油區(qū)4種典型土壤（馬嶺未污染、馬嶺污染、華慶未污染、 華慶污染）土壤樣品碾碎過40目篩，然后將土壤分別裝入4個體積為21.6X 6X21.5cm3的玻璃缸。每缸裝土2kg,每兩缸為一組，分為兩組：第一組：1#為馬嶺未污染土壤，自然條件，分別加0.1%、0.2%、0.5%、 1%、2%、5%、10%、20%、40%的馬嶺含油廢水；2#為馬嶺污染土壤，分別加 營養(yǎng)條件下的0.

8、1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、40%的含油廢水， 攪勻。第二組：3#為華池未污染土壤，自然條件；分別加0.1%、0.2%、0.5%、 1%、2%、5%、10%、20%、40%的馬嶺含油廢水；4#為華慶污染土壤，分別加 營養(yǎng)條件下的0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、40%的含油廢水， 攪勻?？紤]到微生物有一定的存活時間，故擬定本實驗歷時42d，分別于0、7、 14、17、21、24、28、35、42d取樣分析微生物的生長變化過程及污染物的 殘留量。其中2#、4#每次取樣后都添加營養(yǎng)液30mL。培養(yǎng)期間因土壤水分 揮發(fā)，應(yīng)及時添加水分，保

9、持水分含量在18-20%。3微生物數(shù)量測定方法采用稀釋平板法1-3 對真菌、細菌和放線菌進行分離和數(shù)量測定。真菌 的分離用馬丁氏或馬鈴薯培養(yǎng)基；細菌的分離用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;放線 菌的分離用高氏號培養(yǎng)基+重銘酸鉀。準確稱取10 g已過篩土壤，加入盛有 90ml無菌水的三角瓶中，加入玻璃珠后用振蕩儀劇烈振蕩30S，得10-1土壤 懸濁液。充分渦旋后，立即吸取1ml懸濁液加入另一盛有9ml無菌水的試管 中，得10-2 土壤懸濁液。按上述方法依次將土壤稀釋成10-3, 10-4, 10-5 和10-6的懸濁液。4.土壤微生物的分離、統(tǒng)計根據(jù)待分離的微生物類型，分別吸取不同稀釋倍數(shù)的土壤懸濁液(真菌

10、 為10-3,放線菌為10-4,細菌為10-5)0.2m,l加入至預(yù)先制備好的平板培養(yǎng) 基,用無菌涂布器將土壤懸濁液均勻涂布在培養(yǎng)基上，每種處理設(shè)3次重復(fù)。 將培養(yǎng)基在特定溫度下恒溫培養(yǎng)數(shù)天后觀察、統(tǒng)計菌落數(shù)目。真菌培養(yǎng)溫 度為25C，培養(yǎng)時間為67 d;放線菌培養(yǎng)溫度為28C，培養(yǎng)時間為45 d;細 菌培養(yǎng)溫度為30C，培養(yǎng)時間為24 d。根據(jù)不同培養(yǎng)基中生長出的菌落數(shù) 統(tǒng)計真菌、細菌和放線菌數(shù)量，結(jié)合土壤樣品的稀釋倍數(shù)，按照公式:土壤微 生物濃度(cfu/g) = (菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù))/每皿菌液加入量(ml)，求得土 壤中可培養(yǎng)真菌、細菌和放線菌濃度。統(tǒng)計結(jié)果用SPSS 18. 0進行

11、顯著性 方差分析。培養(yǎng)天數(shù)與四種土壤細菌數(shù)量的關(guān)系（X105個/g土）天數(shù)1#土樣2#土樣3#土樣4#土樣01.1052.20.0770.14175.0532.9527.5523.51425.9129.5267178.51767032025120.5219 3544837828.3249 686324031472890054030911235512.5214.54211.80.332.250.17（選題三：需4人完成）石油污染物的生物降解動力學研究3.1.污染物含量測定方法在加入含油廢水后（0天）從4個缸中分別取土樣10g，在7, 14, 17 天時從4個缸中分別取土樣30g,在21天時從4個

12、缸中分別取土樣20g （采 用五點法），分別放入4個索氏提取器中，用150mL沸程為60-90C的石油 醚索氏提取24小時，將提取液移入250mL的容量瓶中，用石油醚定容，用 紫外可見分光光度計測定4個缸中污染物的含量，得到缸中污染物的含量。 用索氏提取的方法提取土樣中的污染物，用紫外分光光度計測得索氏提取 器中土中的石油類物質(zhì)吸光D，根據(jù)馬嶺工作曲線（M=16.4474D-6.3559 ） 和華慶工作曲線（M=12.019D）得到石油類物質(zhì)含量M，然后除以所取土樣 克數(shù)得到不同大數(shù)污染物殘留量，不同大數(shù)不同含有廢水條件下污染物殘 留量（石油類有機質(zhì)），結(jié)果如表7-3-1表7-3-4所示，飽和

13、烴/芳烴和非 烴的殘存量見附表。每次測三個重復(fù)，統(tǒng)計結(jié)果用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。3.2污染物的殘留量的統(tǒng)計結(jié)果表7-3-11#土壤不同天數(shù)石油類有機質(zhì)殘留量（mg/g 土）天數(shù)含油污水濃度（）0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.1360.3010.7881.6263.3128.05115.30231.09266.20570.0740.1770.4781.0052.0704.94510.09119.67140.462140.0500.1290.3580.7671.5933.7537.70714.90330.826170.0560.145

14、0.2780.6251.7103.0466.29113.07229.164210.0190.1490.2050.4600.9792.2184.6368.76218.544240.0170.1480.1940.4390.9382.1154.4308.34917.718280.0230.0780.2260.5021.0652.4325.0639.61620.252350.0140.0570.1810.4120.8841.9814.1627.81316.646420.0160.0630.1910.4330.9252.0834.3668.22217.464表7-3-22#土壤不同天數(shù)石油類有機質(zhì)殘留量

15、（mg/g 土）天含油污水濃度（）數(shù)0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.2050.4301.1112.2424.52711.29622.61345.24690.51370.1110.2430.6391.2982.6386.57413.16926.35952.739140.0870.1960.5211.0632.1685.39810.81821.65643.333170.0950.2120.5611.0422.3265.79411.61023.24046.501210.0640.1480.4020.8251.6924.2098.43916.8993

16、3.819240.0480.0760.3220.7661.3743.4147.84911.71829.457280.0390.1000.2800.5821.2052.9926.00412.02924.079350.0400.1020.2860.5941.2293.0526.12612.27224.565420.0410.1040.2910.6021.2463.0946.20912.43924.0997-3-33#土壤不同天數(shù)石油類有機質(zhì)殘留量（mg/g 土）天含油污水濃度（）數(shù)0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.1080.2140.5681.16

17、62.3535.46211.28421.50745.01470.0420.0940.2390.5091.0382.1744.7088.35618.712140.0410.1190.2020.5341.2891.8024.5638.16623.732170.0400.0910.2320.4951.0092.1034.5668.07118.142210.0260.0620.1600.3490.7181.3763.1125.16412.328240.0240.0580.1510.3310.6831.2872.9354.80911.618280.0270.0660.1670.3640.7471.448

18、3.2565.45112.902350.0220.0530.1380.3070.6341.1652.6904.31910.638表7-3-44#土壤不同天數(shù)石油類有機質(zhì)殘留量（mg/g 土）天含油污水濃度（）數(shù)0.100.200.501.002.005.0010.0020.0040.0000.2020.4321.0412.1124.24410.39920.97941.42783.85470.0940.1970.4981.0262.0734.97210.12319.71640.432140.0780.1650.4180.8671.7544.1758.52916.52834.056170.0790

19、.1690.4260.8831.7854.2548.68716.84434.688210.0770.1680.3240.8781.7763.2308.64116.75134.502240.0480.0740.1720.5750.7691.7134.6058.68018.360280.0310.0710.1830.3970.8131.8233.8267.12215.244350.0370.0850.2170.4640.9492.1614.5038.47517.950420.0380.0860.2180.4670.9542.1754.5298.52818.0563.3污染物的生物降解率及其動力學特

20、征用每一次測得的殘留量數(shù)據(jù)與0天時的數(shù)據(jù)相除，得出不同天數(shù)殘留 量與第一天相比的相對值（相對殘留量%），然后繪出不同天數(shù)測得的污染物 相對殘留量與不同天數(shù)細菌總數(shù)變化圖（表7-3-7）。以濃度為2%的含油廢 水在微生物作用下污染物相對殘留量值為例（表7-3-8），計算降解率與降 解系數(shù)。結(jié)果表明相對殘留量總的趨勢是減小，但降解過程中還是有一些 波動。1#和2#中的土樣在第13天時降解已經(jīng)達到52%。21天時，1#的相對 殘留量達到一個最低值，這與細菌的數(shù)量在21-28天時最大是基本符合的； 24天時，2#的相對殘留量達到一個最低值，這與細菌的數(shù)量在24-28天時 最大是基本符合的。3#和4#中

21、的土樣在第7天時降解已經(jīng)達到51%-55%。 21天時，3#的相對殘留量達到一個最低值，這與細菌的數(shù)量在21-24天時 最大是基本符合的；24天時，4#的相對殘留量達到一個最低值，這與細菌 的數(shù)量在24-28天時最大是基本符合的?？偟膩碚f，在0-13天時3#和4#中降解率比1#和2#中的快一些，這可能是在未經(jīng)培養(yǎng)過的華慶土壤中的細 菌比馬嶺土壤中的細菌多。另外，在第17天時，1#和2#土樣都出現(xiàn)一個峰 值；在13天時，3#土樣出現(xiàn)一個峰值；在21天時4#土樣出現(xiàn)一個峰值； 原因可能是細菌在降解污染物時，產(chǎn)生的代謝物與污染物結(jié)構(gòu)相似。同時，可以明顯看出1#和2#土樣的生物降解過程在前13天符合一

22、級 動力學方程；3#和4#土樣的生物降解過程在前7天符合一級動力學方程。 所以1#和2#土樣且對13天前的降解作動力學研究；3#和4#土樣且對7天 前的降解作動力學研究。表7-3-72%含油廢水在微生物作用下污染物相對殘留量值（）天數(shù)1#2#3#4#0100.00100.00100.00100.00762.5058.2844.1048.841448.1047.8954.7741.331751.6351.3942.8942.072129.5637.3830.5441.852428.3221.5126.9418.122832.1426.6231.7619.163526.7027.1626.9422

23、.354227.9327.5325.9322.48星里留殘對相0.00% 0714172124283542天/d100.00%80.00%60.00%40.00%20.00%圖7-3-2 2%含油廢水在微生物作用下污染物降解曲線12001000圖7-3-3細菌總數(shù)變化圖1#2#3#4#土 0 5 0細根據(jù)一級動力學方程K=0.693/t0.，得到馬嶺和華慶地區(qū)生物降 解半衰期和降解系數(shù)（表7-3-8）。華慶原油的生物降解系數(shù)比馬嶺 原油的生物降解系數(shù)大，這是因為華慶油田的土壤中降解菌數(shù)量比馬 嶺油田的土壤中降解菌數(shù)量多。表7-3-8 生物降解特征華慶馬嶺編號1#2#3#4#t0.5 (d)12

24、.5212.476.26生物降解系數(shù)(mg/d)0.05540.05560.11070.1013(選題四：需要4人)4.微生物的富集與分離土壤樣品：取自油田土壤，取土表及以下5 cm 15 cm的耕層土 壤。培養(yǎng)基的選擇方法一，需2人(參考氯嘧磺隆降解菌的分離鑒定及 其降解特性)LB培養(yǎng)基(g):酵母粉5,蛋白胨10, NaCl 5,蒸餾水定容 至 1 L。無機鹽培養(yǎng)基(g): K2HPO4 0.5, KH2PO4 0.5,葡萄糖 5, NaCl 0.2, MgSO4 - 7H2O 0.2, CaCl2 0.1,蒸餾水定容至1 L, 添加不同 體積原油母液(1000 mg/L)。2.2原油降解

25、菌株富集與分離取10 g 土樣放入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，加適 量玻璃珠搖床振蕩約30 s,使樣品與水充分混合，將細胞分散, 形成均勻的菌懸液。以10%的接種量接到含100 mg/L原油的無機鹽 培養(yǎng)基中，置30C、150 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)。以后每周移種 一次，以接種量10%接入新鮮的無機鹽培養(yǎng)基中，原油濃度以100 mg/L的梯度遞增，至培養(yǎng)基中原油濃度達到500 mg/L。經(jīng)初篩、 復(fù)篩和純化后，將分離的幾株降解菌接種于LB斜面上，編號，4 C 冰箱中保存。2.3原油降解菌株的鑒定。培養(yǎng)基的選擇方法二，需2人（參照石油烴降解菌的篩選與鑒定）富集篩選培養(yǎng)基（g/L）:

26、NaNO3 2，K2HPO4 0.5，KH2PO4 1，無水 MgS040.05,無水 CaCl2 0.01, NaCl 0.5, FeSO4 . 7H2O 0.01, PH7.2, 石油5。選擇鑒定培養(yǎng)基（g/L）： NaNO3 2, K2HPO4 0.5, KH2PO4 1,無水 MgSO40.05,無水 CaCl2 0.01, NaCl 0.5, FeSO4 . 7H2O 0.01,瓊脂 18, pH7.2，石油 53.3菌種純化培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨（g/L）：牛肉膏3,蛋白胨10, NaCl 5,瓊脂 18, pH7.4-7.6o3.4斜面保存培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨3.5石油降解菌的富集

27、分離無機鹽培養(yǎng)基中加0.5% （W/V）原油樣品，30C搖床培養(yǎng)7d，取5ml 液接到相同新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)7d。如此連續(xù)富 集培養(yǎng)取0.5ml在固體無機鹽培養(yǎng)基平板上涂布，用微型噴霧器噴撒 原油，使原油為05%,在30C溫箱中培養(yǎng)20天，選擇在原油平板上 生長的菌株在牛肉膏胨培養(yǎng)基上純化。純化好的菌株再在固體無機鹽 培養(yǎng)基平板上劃線，然后再型噴霧器噴撒原油，使原油濃度仍為 0.5%。放置在30C溫箱中培養(yǎng)，選擇油平板上生長較快的菌株，用 牛肉膏蛋白胨進行劃線純化，純化后的菌株以膏蛋白胨斜面保存 63。在液體LB中接入原油降解菌，生長好后加入甘油，油終濃度 為25%,置-20笆

28、冰箱保存。2.6高效降解菌株的篩選3.6.1培養(yǎng)方法 3.6.1.1種子培養(yǎng) 于新鮮斜面上取兩環(huán)菌，接至裝有30ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中C, 180rpm振蕩培養(yǎng)24ho3.6.1.2搖瓶培養(yǎng) 按5%接種量，將培養(yǎng)24h種子液接入50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三 角瓶30C, 180 rpm培養(yǎng)10d。為減少測定誤差，每個樣品均做三個 平行樣，同不接種微生物的搖瓶作為對照以扣除非生物影響。3.6.2石油降解菌除油率的測定在液體原油培養(yǎng)基中接種石油降解菌，經(jīng)搖床培養(yǎng)后，加入20ml石 油（30-60）C萃取，并將培養(yǎng)液5000r/min離心10min，轉(zhuǎn)至分液 漏斗，振蕩次，靜置，待分

29、層后分離，收集上層液，用石油醚洗滌 2-3次，合并上層液在烤箱中65C蒸干，冷卻后稱重。除油率的計算除油率=（m3 一m2）/m1 X100%m3對照組的殘余油量，m2降解后的殘余油量，m1最初的含油量。（選題五、需要6人）：降油因素研究（參考氯嘧磺隆降解菌的分離鑒定及其降解特性）1.確定初始條件一致：在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 24 h （OD600=后 ，按5%的量接種無機鹽培養(yǎng)基中，初始pH值為？r/min恒溫搖初始原油濃度為？ mg/L,溫度為？ C, 床振蕩培養(yǎng)，分別進行以下幾組處理測定生長量和降解率的變化， 每種處理設(shè)3個平行試驗，同時設(shè)接種滅活的菌株為對照，培養(yǎng)7 d后測定OD6

30、00值和氯嘧磺隆的殘留量。每隔24 h取樣測定菌株生長量和降解率的變化。將溫度分別設(shè)置為20 C、25 C、30 C、35 C、40 C、45 C作為最佳溫度試驗組。用NaOH或HCl調(diào)節(jié)初始pH值分別至1、4、5、6、7、8、9作為 最佳pH試驗組。將接種量分別設(shè)置為2%、5%、10%、15%、18%、20%作為最佳接種 量試驗組。將原油濃度分別設(shè)置為10、50、100、200、300、400 mg/L作為 最佳降解濃度試驗組。將菌株的培養(yǎng)時間、隊接種量、溫度、原油濃度都設(shè)置為優(yōu)化 后的最佳條件，測定原油的降解率。(選題六，需要2人)6翻耕和加入膨松劑改良土壤強化降解效果實驗1 5.1生物菌

31、劑制備以含油土壤為菌源，以原油為唯一碳源進行上述篩選分離，得到高 效石油降解菌，將斜面培養(yǎng)的菌株進行活化,在無菌條件下，高速離心 后,棄去上清液，離心管內(nèi)的菌體在無菌室內(nèi)37C干燥48h制成固體生 物菌劑備用。取一定量固體生物菌劑加入到無菌緩沖溶液中，使固體菌劑全部 分散制成菌懸液;把富集培養(yǎng)基按一定比例加入到膨松劑鋸末后濕熱 滅菌；然后把菌懸液加入滅菌后的培養(yǎng)基和鋸末中并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h制成擴大菌劑；最后將配制好的菌劑接種到被石油污染的土壤中。1 5.2試驗設(shè)計為尋找生物修復(fù)石油污染土壤的強化處理方法，進行添加膨松劑 和翻耕處理的生物修復(fù)模擬試驗。試驗在盆缽（直徑為15cm，高15cm

32、） 中進行，每組試驗用土 1000g，人為添加污染源2g，各組試驗的具體處 理措施如下表：項目菌劑量（mg/kg）鋸末劑量（g）處理翻耕和劑量00靜置0.60靜置0.680靜置00每天翻耕一次0.60每天翻耕一次0.680每天翻耕一次翻耕頻率0.680每天翻耕一次0.680每三天翻耕一次0.680每五天翻耕一次0.680靜置每一組做兩個平行樣。試驗在實驗室常溫條件下進行。間隔一段 時間采樣，并測定土壤中石油含量、微生物數(shù)量、電導率、含水率及pH值，隨著土壤中石油去除率的降低，采樣間隔逐漸增大。石油類含量采用紫外分光光度法測定；電導率（EC）采用電導率 儀測定；PH值采用精密PH計測定，電導率和

33、?日測定按土壤和水體 積比為1：5 （W/ V）；含水率采用恒重法測定。（選題七，需要2人）：添加營養(yǎng)劑強化修復(fù)土壤實驗1.6.1實驗材料主要培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；MRS培養(yǎng)基；YEPD 培養(yǎng)基。有機肥：腐植酸、諾沃肥（由天津市諾維信生物技術(shù)有限公司提供， 為酶制劑經(jīng)分離后形成的發(fā)酵殘渣，其主要成分是發(fā)酵過程中未消耗盡的農(nóng)產(chǎn)品、營養(yǎng)鹽以及酶分離所使用的硅藻土等助濾物質(zhì)。）、生 物有機鈣（主要成分為貝殼粉）。1.6.2混合菌劑的培養(yǎng)采用三級擴大培養(yǎng)法。在30C、200r min-i條件下，將優(yōu)勢降油 菌種分別培養(yǎng)，經(jīng)平板稀釋法檢查菌落數(shù)大于1X10i0cfumL-i后， 以腐植

34、酸-諾沃肥（1 ： 1）粉末為載體將菌液等體積同時吸附于載體 上（載體與菌液的質(zhì)量比為2.5 ： 1）制備成菌劑，密封于聚乙烯塑料 袋內(nèi)，室溫保存。1.6.3 土壤中細菌數(shù)量和石油烴含量測定用平板計數(shù)法測定土壤中細菌的數(shù)量。土壤中總石油炷含量的測 定采用重量法。用索式提取法提取土壤中的總石油炷，計算每克干土 中總石油烴含量，進而按下式計算石油烴降解率:石油烴降解率=叫叫）M1X100%式中：M1為第1天土壤中總石油烴含量，mgkg-i；M|為第i天土壤 中總石油烴含量，mg kg-i。1.6.4 土壤鹽堿化的改良及模擬原位修復(fù)處理方法首先，對土壤進行鹽堿改良，取200g澆1次透水（即花盆底部有

35、 水滲出）后自然風干的土樣，再加入5%腐植酸-諾沃肥（1 : 1）粉末 （W/W）、5%生物有機鈣和2%磷酸二氫銨并充分混合均勻。然后，將 改良后的土壤裝入花盆，分別按照0 （記為CK）、2%、4%、8%的比例 加入混合菌劑，混合均勻后于室溫下培養(yǎng)，每周澆水兩次，保持含水 率20%左右。每個處理設(shè)置3個平行。分別于第1、4、8、16、32、48 和64d測定石油烴降解率、土壤中細菌總數(shù)、電導率、含水率及?日 值。（選題八，需要4人）：石油降解菌劑對土壤耐堿、耐鹽、溫度、濕度等調(diào) 控因子的適應(yīng)實驗17.1 土壤溫度的調(diào)控溫度是影響微生物生長與存活的重要因素之一，微生物的活動強度、生化作用都與此相

36、 關(guān)。溫度的過高或過低都可抑制微生物生長或?qū)е挛⑸锼劳霏h(huán)境中的微生物均在一定的 溫度范圍內(nèi)生存，溫度的適中可使細菌細胞中的生物化學反應(yīng)速率加快。試驗階段監(jiān)測地表 的最高和最低溫度數(shù)據(jù)。在試驗區(qū)用農(nóng)用塑料薄膜進行保溫，使試驗區(qū)土壤溫度保持在25r以上，但進入9月后 因氣溫明顯下降夜晚再用草簾覆蓋。通過試驗可得出在該地區(qū)利用微生物生態(tài)修復(fù)技術(shù)的最 佳時期，以及通過調(diào)控可使土壤溫度保持在20C以上的辦法。土壤含水量、易溶鹽（TDS）、NH4+、NO3含量分析水是細胞生存不可少的物質(zhì)，也是微生物對石油污染物降解過程中的重要介質(zhì)和氧的 來源。因此在試驗區(qū)要使土壤保證需要的水量，一般保持在20%左右，在

37、每次取樣后加入約4% 左右的水，使試驗層土壤含水量保持穩(wěn)定這一含量基本能保證試驗效果。并在實驗區(qū)測定 當?shù)赝寥乐兴腡DS、NH4+、NO3含量。土壤中氧的調(diào)控環(huán)境條件的調(diào)控包括氧氣的供給，氧的供應(yīng)成為微生物降解有機物過程的重要調(diào)控因 子之一。供氧量的多少能影響微生物細胞內(nèi)許多酶的活性和細胞的呼吸作用，控制著微生物 的生長和對有機物的降解能力。尤其是對石油污染的微生物降解尤顯重要一般每氧化3.5g 石油需要1g 02。只有在氧充分的條件下才能迅速降解。本試驗主要從3個方面對土壤氧的 供給進行了調(diào)控，首先是充分翻耕土壤并且在每次取樣后均要翻耕試驗層，使其充分與大氣 混合。其次是保證試驗土壤具有一

38、定的含水量，水中提供的氧。另外是利用鋸末作為添加劑, 該添加劑不僅廉價易取，并能為土壤補充營養(yǎng)素，而且對試驗層土壤條件進行了改良增大了 蓬松性和通透性，使空氣中的氧容易進入。加入的營養(yǎng)元素N03-不僅增加氮源也是氧的來源 之一。上述調(diào)控措施為微生物降解土壤中的石油提供了充分的氧源。1.7.4 pH對降解率的影響環(huán)境的pH對微生物的生命活動有一定影響，它可引起細胞膜電荷的變化，而影響微生 物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及酶的活性，并使環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可利用性和有害物質(zhì)的毒性改 變。每一種微生物的生存都有一定的pH值范圍和最適pH值。大多數(shù)細菌的最適pH值為 6.5-7.5,放線菌pH值為7.5-8.0,真

39、菌可以在廣泛pH范圍內(nèi)生長發(fā)育，如pH值在3以下 9以上仍能生長，最適在5-6。試驗區(qū)可加入一定量的磷酸鹽緩沖劑使pH值保持在7-9,大 多在8左右，而大部分石油降解菌最適環(huán)境為偏堿性。用濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖劑將無機鹽培養(yǎng)基的pH值調(diào)整到4.0、5.0、6.0、7.0、 8.0和9.0，滅菌后分別接種降解菌，于28C、120r/min搖床上恒溫培養(yǎng)，7d后測定降解體 系中的原油降解率,以確定菌株降解原油的最適pH值。1.7.5鹽度對降解率的影響培養(yǎng)基的鹽度分別為0、2、4、6、8g/L,加入無機鹽培養(yǎng)基滅菌后分別接種降解菌，于 28C、120r/min搖床上恒溫培養(yǎng),7d后測降解率，以確定菌株降解原油的最適鹽值。1.7.6試驗過程對下層土壤的影響試驗完成后對試驗各區(qū)下部土壤不同深度進行了石油、pH、含水量、易溶鹽(TDS)、NH4+、 no3-含量測試。從測試結(jié)果可見試驗區(qū)試驗層的下部土層石油含量的變化。與對照區(qū)對比 說明試驗層土壤中石油是否向下擴散或是被降解，從pH、含水量、易溶鹽、NH4