臨床生物化學(xué)：第30章 層析法測(cè)定生化物質(zhì)

1、第三十章 層析法測(cè)定生化物質(zhì)第2頁教學(xué)目標(biāo)與要求 掌握糖化血紅蛋白測(cè)定原理；HPLC原理。 熟悉層析法的原理與分類；糖化血紅蛋白測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化；氨基酸測(cè)定方法；兒茶酚胺測(cè)定方法。 了解骨型堿性磷酸酶及TDM測(cè)定。第3頁第3頁第3頁體液氨基酸的測(cè)定糖化血紅蛋白測(cè)定治療藥物的測(cè)定 其他生化物質(zhì)測(cè)定層析分析技術(shù)概述主要內(nèi)容第4頁第一節(jié)層析技術(shù)概述一、層析技術(shù)(chromatography technology)：定義：利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)(如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)的差別，使各組分在支持物上分離的技術(shù)。層析技術(shù)可與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，檢測(cè)出層析后各組

2、份的濃度或質(zhì)量。繪出層析圖，根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積,進(jìn)行定性及定量分析。第5頁層析技術(shù)原理層析系統(tǒng)由兩相組成：一是固定相，另一是流動(dòng)相流動(dòng)相：攜帶流過整個(gè)系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動(dòng)的一相第6頁層析技術(shù)概述色譜圖檢測(cè)器的響應(yīng)R基線b進(jìn)樣峰進(jìn)樣峰a進(jìn)樣峰h123時(shí)間t(min)tRatR1tR2tR3第7頁層析技術(shù)概述高分辨率、高靈敏度、選擇性好、樣品量少、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)適合于標(biāo)本含量少,雜質(zhì)含量多樣品分析尤其適用于生物樣品的分離分析層析技術(shù)成為已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法，是生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等研究領(lǐng)域必不可少的手段和工具。第8頁二、層析技術(shù)發(fā)展史1903年，俄國植物學(xué)家

3、茨維特-將碳酸鈣裝入玻璃管內(nèi)，成為柱形-抽提植物葉子得色素溶液，通過碳酸鈣柱-石油醚洗滌柱子上下：葉綠素b,a,葉黃素，胡蘿卜素-混合物的不同組分得到了分離-得到的色帶稱為色譜，方法命名為色譜法第9頁1931年，德國庫恩重復(fù)茨維特實(shí)驗(yàn)，并分離60多種色素1941年，英國生物化學(xué)家馬丁發(fā)展了色譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了液-液即分配色譜法預(yù)測(cè)并實(shí)現(xiàn)氣相色譜技術(shù)，1952年將色譜技術(shù)原理應(yīng)用到分離氣體上，混合氣體通過后，在另一端出現(xiàn)時(shí)得以分離。20世紀(jì)60年代，普通色譜法已經(jīng)不能滿足人們對(duì)生物成分分析測(cè)試的要求 -高效液相色譜，high performance liquid chromatography即HPL

4、C第10頁三、層析技術(shù)分類吸附層析法柱層析法（高效液相層析）層析法氣相層析超臨界層析法液相層析薄層層析法紙分配層析法其他分配層析法正相分配層析法反相分配層析法毛細(xì)管電泳凝膠滲透層析法離子交換層析法親和層析法第11頁三、層析技術(shù)分類吸附層析法(absorption chromatography)：固定相是固體吸附劑，利用各組份在吸附劑表面吸附能力的差別而分離。分配層析(partition chromatography)：固定相為液體，利用各組份在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。離子交換層析(ion exchange chromatography)：是以具有離子交換性能的離子交換劑作固定相，利用他與

5、流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。第12頁三、層析技術(shù)分類凝膠層析（gel chromatography）：固定相為多孔性凝膠，利用各組份的分子大小、形狀不同，在凝膠上受阻滯的程度不同而得到分離。親和層析(affinity chromatography)：利用待分離物質(zhì)和他的特異性配體間具有特異親和力從而與其他組份分離，如免疫親和層析。以上各種層析法常應(yīng)用于柱層析 (column chromatography)中，即將固定相裝于柱內(nèi)，使標(biāo)本沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。第13頁收集不同的組分第14頁免疫親和層析原理：將層析技術(shù)與免疫標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合測(cè)定抗原抗體的方法。特

6、點(diǎn)：簡單、快速、特異、靈敏，不需要任何儀器設(shè)備和試劑。第15頁免疫親和層析 第16頁離子交換層析原理示意圖第17頁高效液相層析高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。 在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。由于固相填料顆粒小而均勻，會(huì)引起高阻力，采用高壓輸送流動(dòng)相，可大大加快分析速度，故又稱高壓液相色譜。高效液相色譜儀一般由高

7、壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)系統(tǒng)等組成。 特別適用于高沸點(diǎn)、不能氣化或熱穩(wěn)定性差的有機(jī)物分離分析。第18頁高效液相色譜法高壓泵進(jìn)樣裝置色譜柱電化學(xué)檢測(cè)器紫外光檢測(cè)器溫控裝置高壓、高效、高分辨率、高速、應(yīng)用廣第19頁正相層析法：固定相極性大于流動(dòng)相極性正相層析法一般可用于分離純化極性大的分子，如磷脂、甾體化合物、脂溶性維生素、前列腺素等。反相層析法：流動(dòng)相極性大于固定相極性用于分離非極性或弱極性化合物，如氨基酸和多肽的分析,蛋白質(zhì)的分離、堿基、核酸和核酸酶的分析、甾體化合物。第20頁第20頁第20頁一、氨基酸測(cè)定方法概述紙層析和薄層層析法用于氨基酸定性分析化學(xué)法、酶法和層析法用于氨基

8、酸定量分析化學(xué)法：比色法和熒光法酶法層析法 離子交換層析法 HPLC法第二節(jié) 體液氨基酸測(cè)定第21頁第21頁1.紙層析和薄層層析第21頁分離鑒定微量氨基酸最簡易有效的方法不需特殊設(shè)備和操作簡單采集在濾紙上的標(biāo)本可以郵寄紙層析靈敏度低、分辨率差、費(fèi)時(shí)已經(jīng)逐漸被速度快、分辨率和靈敏度高的薄層色譜所代替均為定性檢測(cè)第22頁第22頁2化學(xué)比色法第22頁某些化學(xué)物質(zhì)和特異性的氨基酸起反應(yīng)可以產(chǎn)生有色物質(zhì)比色法： 根據(jù)氨基酸與茚三酮加熱產(chǎn)生顯色物質(zhì)，來定量總氨基酸含量熒光法：色氨酸和甲醛縮合，并被三氯化鐵氧化，生成熒光物質(zhì)去甲哈爾曼，用熒光分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)靈敏度高第23頁第23頁3酶法分析第23頁

9、利用脫氫酶催化同時(shí)伴有NAD+與NADH之間的轉(zhuǎn)化,在340 nm監(jiān)測(cè)吸光度的變化,可測(cè)定氨基酸的含量。利用氧化酶氧化生成H2O2，偶聯(lián)trinder反應(yīng)，測(cè)定生成的醌亞胺的吸光度的變化。 第24頁第24頁第24頁 二、離子交換層析法測(cè)定氨基酸離子交換層析用離子交換劑作固定相固定相中的基團(tuán)與流動(dòng)相中的離子進(jìn)行可逆的交換氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的pI和溶液的pH。分離樣品混合物，其中帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來。氨基酸分析儀，可對(duì)蛋白質(zhì)水解液和各種游離氨基酸的組分進(jìn)行定量分析。第25頁離子交換層析原理示意圖氨基酸分析儀：采用經(jīng)典的陽

10、離子交換色譜分離、不同pH值離子濃度的緩沖液洗脫、茚三酮柱后衍生法比色。第26頁三、高效液相色譜法定量分析氨基酸及衍生物的技術(shù)在氨基酸上標(biāo)記能產(chǎn)生熒光或紫外有較強(qiáng)吸收的化學(xué)物質(zhì)HPLC分離后可以直接用熒光檢測(cè)儀或紫外檢測(cè)儀高靈敏度地檢測(cè)和定量各種氨基酸第27頁離子交換層析法耗時(shí)長，分析過程復(fù)雜。HPLC法準(zhǔn)確可靠、標(biāo)本用量少，被廣泛應(yīng)用。HPLC法樣品準(zhǔn)備復(fù)雜、操作要求高、儀器價(jià)格昂貴、層析柱壽命短等缺點(diǎn)。四、性能評(píng)價(jià)第28頁第28頁第28頁第二節(jié) 糖化血紅蛋白測(cè)定一、糖化血紅蛋白測(cè)定方法概述根據(jù)糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷的差異，區(qū)分HbA0和HbA1c，如離子交換層析和電泳法根據(jù)糖化與非糖

11、化血紅蛋白的結(jié)構(gòu)差異和Hb上糖化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用親和層析和免疫法測(cè)定。離子交換HPLC親和層析免疫化學(xué)第29頁原理： 糖化導(dǎo)致GHb分子表面陽離子丟失， HbA1c與其他Hb帶電荷不同。采用偏酸緩沖液處理陽離子交換樹脂，使之帶負(fù)電荷。HbA帶正電荷較多，吸附率較高。在低離子強(qiáng)度和中性pH的洗脫液條件下, 由于HbA1c幾乎不帶正電荷,從而在HbA前先洗脫,再用高離子濃度洗脫液將HbA洗出,測(cè)定洗脫液中的HbA1c占總Hb的百分?jǐn)?shù)。二、離子交換層析法第30頁方法學(xué)評(píng)價(jià)： 易受HbA1c前體（Schiff堿）、胎兒血紅蛋白( HbF)、衍生血紅蛋白（甲?；蛞阴；t蛋白）及變異血紅蛋白（Hb

12、S、HbC、HbE和HbD）等因素的干擾，pH和溫度對(duì)結(jié)果有較大的影響，易產(chǎn)生偏差。手工微柱法：操作方法和微柱的質(zhì)量不易控制,易產(chǎn)生誤差。全自動(dòng)離子交換高效液相色譜(HPLC)法第31頁全自動(dòng)離子交換高效液相色譜(HPLC)法是糖化血紅蛋白測(cè)定的參考方法。能分離HbA1a、HbA1b和HbA1c和HbA0?？朔藀H、溫度及其他一些影響因素。不受胎兒血紅蛋白( HbF)、氨甲?；t蛋白和不穩(wěn)定A1c干擾。第32頁Bio-Rad Variant 第33頁Bio-Rad Variant第34頁Bio-Rad Variant第35頁原理： 以氨基苯硼酸瓊脂糖凝膠為固相，GHb分子表面的葡萄糖1,2

13、-順式二糖醇與固相上的硼酸基團(tuán)特異結(jié)合，形成可逆的五環(huán)化合物，而非糖化Hb則被洗脫，然后用高濃度山梨糖醇緩沖液洗脫GHb，測(cè)定并計(jì)算出GHb的百分率，以相當(dāng)于“HbA1c”來報(bào)告結(jié)果。三、親和層析法第36頁方法學(xué)評(píng)價(jià)操作簡單、快速、價(jià)廉,特異性強(qiáng)對(duì)經(jīng)翻譯以后修飾的血紅蛋白和病理血紅蛋白的影響相對(duì)不敏感,不受異常血紅蛋白的干擾對(duì)血標(biāo)本儲(chǔ)存的時(shí)間不如離子交換法嚴(yán)格檢測(cè)結(jié)果為糖化血紅蛋白總量（HbA1）, 不能分離出HbA1c等各條帶。親和層析HPLC法精密度較好，室內(nèi)變異系數(shù)CV在2%以內(nèi)。第37頁P(yáng)rimus ultra2第38頁P(yáng)rimus ultra2層析柱糖化血紅蛋白層析圖第39頁第39頁

14、第39頁四、免疫法 原理：利用抗原抗體反應(yīng)的原理設(shè)計(jì)。以HbA1c的鏈N-末端提供了一個(gè)容易被抗體識(shí)別的抗原表位，可以采用單克隆抗體特異性識(shí)別，以糖化血紅蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合比色或比濁法，測(cè)定HbA1c的含量，再測(cè)定血紅蛋白的含量，最后計(jì)算出HbA1c占總血紅蛋白的百分?jǐn)?shù)。第40頁方法學(xué)評(píng)價(jià)高濃度樣本測(cè)定結(jié)果偏低。此法的特異性比目前的一些方法高試劑盒抗體濃度不能達(dá)到相關(guān)高度，需要稀釋樣本。受變異血紅蛋白干擾。第41頁第41頁（一）HbA1c檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)1患者無需空腹，可以任意時(shí)間采血，不受進(jìn)餐的影響。2較靜脈血糖更能反映長期的血糖情況（8-10周平均血糖水平），不受短期飲食、運(yùn)動(dòng)等生活方式變化的影響

15、。3一些非血糖因素影響HbA1c而引起的誤差少見，如血紅蛋白病。 4HbA1c實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法正在開始標(biāo)準(zhǔn)化。第41頁四、糖化血紅蛋白檢測(cè)指標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)和局限性第42頁第42頁（二）HbA1c的局限性 HbA1c檢測(cè)結(jié)果對(duì)調(diào)整治療后的評(píng)估存在“延遲效應(yīng)”，不能精確反映患者低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，也不能反映血糖波動(dòng)的特征。第42頁五、糖化血紅蛋白的測(cè)定方法性能評(píng)價(jià)四、糖化血紅蛋白檢測(cè)指標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)和局限性第43頁第43頁第43頁五、影響HbA1c檢測(cè)結(jié)果的因素1血紅蛋白的更新速度對(duì)HbA1c數(shù)值的影響 (1)可以引起紅細(xì)胞平均壽命增加的因素都會(huì)增加HbA1c的濃度，如脾切除后紅細(xì)胞清除率下降。 (2)可能縮短紅細(xì)胞

16、壽命的因素可降低HbA1c，如溶血性貧血。接受透析治療尿毒癥患者紅細(xì)胞壽命縮短。第44頁第44頁五、糖化血紅蛋白的測(cè)定方法性能評(píng)價(jià)2. 藥物 維生素C、維生素E、大劑量的水楊酸鹽、促紅細(xì)胞生成素治療者可使測(cè)定結(jié)果降低。3. 種族差異 HbA1c存在種族差異，黑種人的HbA1c比白種人高0.40.7。 4.樣本貯存時(shí)間與溫度測(cè)定結(jié)果可隨樣本貯存時(shí)間的延長而逐漸升高。大多數(shù)檢測(cè)方法的樣本可在-70保存1年，全血樣本可在4保存1周，在室溫條件下，僅能保存數(shù)天。在37條件下，有效保存時(shí)間均小于1天。第45頁第45頁第45頁六、糖化血紅蛋白測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化目的：實(shí)現(xiàn)HbA1C測(cè)定結(jié)果的可溯源性和可比性，保證

17、檢驗(yàn)質(zhì)量。核心：建立參考方法參考物質(zhì)階段：國家、地區(qū)化全球化第46頁第46頁第三節(jié) 治療藥物測(cè)定一、TDM的方法學(xué)概述 體液中的藥物為微量，其檢測(cè)不僅受結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)源性物質(zhì)干擾，還易受和原型藥僅有微小差別的代謝物干擾。而一些藥物除原型藥外，還需同時(shí)測(cè)定具藥理活性的代謝物，對(duì)檢測(cè)方法有較高要求。因此,常規(guī)的檢測(cè)方法不能滿足藥物檢測(cè)的靈敏度與特異性的要求。目前常用的體液中藥物濃度測(cè)定法有層析法、免疫化學(xué)方法等。第47頁定量薄層色譜法氣相色譜法、高效液相色譜法HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-tandem mass spectrometers, LC-MS)特點(diǎn)：分離度好、專屬性強(qiáng)、可同時(shí)測(cè)定幾種藥物。

18、 1.色譜法第48頁放射免疫法酶免疫法熒光免疫（熒光偏振免疫法）化學(xué)發(fā)光免疫法等2.免疫化學(xué)方法第49頁第49頁（1）光譜分析法 可見光紫外分光光度法（UV）、熒光分光光度法、火焰發(fā)射光譜法和原子吸收光譜法等。（2）毛細(xì)管電泳技術(shù)（3）抑菌試驗(yàn)第49頁3.其他技術(shù)第50頁第50頁1氣相色譜法:丙戊酸濃度測(cè)定樣品預(yù)處理上樣、分析2高效液相層析法： 采用反相高效液相色柱分離和紫外檢測(cè)器(或其他檢測(cè)器)檢測(cè)?？赏瑫r(shí)監(jiān)測(cè)幾種抗癲癇藥物。第50頁二、抗癲癇藥物的層析法測(cè)定第51頁第51頁1氣相層析法 對(duì)那些熔點(diǎn)高、揮發(fā)性差、對(duì)熱不穩(wěn)定或極性大的藥物此法不太適合。2高效液相層析法 可與質(zhì)譜聯(lián)用，迅速地對(duì)藥

19、物進(jìn)行定性、定量分析。第51頁三、層析法測(cè)定抗癲癇藥的方法性能評(píng)價(jià)第52頁第52頁第四節(jié) 其他生化物質(zhì)的層析法測(cè)定一、兒茶酚胺激素測(cè)定 腎上腺素(epinephrine,E)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)（約占1030%）及微量的多巴胺(dopamine,DA)。這三種具有生物活性的物質(zhì)在化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有兒茶酚（鄰苯二酚）及連接其上的乙胺側(cè)鏈，生理功能也有許多共同點(diǎn)，故統(tǒng)稱為兒茶酚胺（catecholamines，CA)。主要為嗜鉻細(xì)胞分泌，其血和尿中測(cè)定對(duì)診斷嗜鉻細(xì)胞瘤有重要意義。第53頁第53頁第53頁（一）測(cè)定方法概述HPLC法、氣相色譜法熒光法、放射酶學(xué)法香草扁桃

20、酸（VMA）、高香草酸（HVA）是兒茶酚胺的代謝終產(chǎn)物。 早期有化學(xué)比色法、紙層析、薄層層析、醋酸乙酯高壓電泳法等,精確性差,費(fèi)時(shí)。近年來, HPLC法測(cè)定尿中VMA較多。第54頁第54頁第54頁（二）高效液相法測(cè)定血和尿兒茶酚胺1.原理： 血漿或尿液樣品需要預(yù)處理。標(biāo)本中加入內(nèi)標(biāo)物（3，4-二羥基苯乙酸），在堿性條件下兒茶酚胺被活性氧化鋁吸附，離心棄取上清液；加去離子水反復(fù)清洗至中性后，加入高氯酸反抽提氧化鋁中的兒茶酚胺，吸取上清液進(jìn)樣檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)液加入內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行同樣處理。在C18反相層析柱上待測(cè)液經(jīng)HPLC分離，洗脫液用電化學(xué)或熒光檢測(cè)儀進(jìn)行定量。 第55頁第55頁1.標(biāo)本處理：預(yù)處理：采用

21、氧化鋁吸附法或微小柱預(yù)處理法。標(biāo)本保存：低溫、避光、冰凍保存。2.患者準(zhǔn)備：應(yīng)激激素：安靜狀態(tài)下采血。血壓升高時(shí)采集最好。高度懷疑者，應(yīng)多次檢測(cè)。 24h尿：濃鹽酸防腐，堿性條件下易降解。藥物：采血前3-7日停用降壓藥。3.不足：需特殊儀器、填充柱價(jià)格昂貴、流動(dòng)相消耗量大、檢測(cè)成本高。第55頁（三）高效液相法測(cè)定血中兒茶酚胺性能評(píng)價(jià)第56頁Waters 高效液相儀第57頁兒茶酚胺激素標(biāo)準(zhǔn)品層析圖第58頁血清標(biāo)本層析圖第59頁尿液標(biāo)本層析圖第60頁第60頁堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是一組底物特異性較低，在堿性條件下能水解磷酸單酯化合物的酶。同工酶分為四型：腸型

22、（IAP）、生殖細(xì)胞型（GCAP）、胎盤型（PALP）和非特異組織型（TUAP）。 血清中骨性堿性磷酸酶（bone alkali phosphatase，B-ALP）是近年來主要用于小兒佝僂病早期診斷和亞臨床鑒別的特異性參考指標(biāo),也是目前用于評(píng)價(jià)人體骨礦化障礙的最佳指標(biāo)。第60頁二、骨型堿性磷酸酶測(cè)定第61頁第61頁（一）骨型堿性磷酸酶測(cè)定方法概述 采用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法先識(shí)別或分離出B-ALP，再測(cè)定其堿性磷酸酶的活性。1高效液相層析法 是ALP同工酶分辨率最高的一種檢測(cè)方法,能夠清楚分出B-ALP。乙酸以0.8m1/分流速，流經(jīng)一種薄的陰離子交換柱，梯度洗滌ALP同工酶。柱后流出物與底物混合，于405nm波長檢測(cè)產(chǎn)物對(duì)硝基酚的含量。第