半薄超薄切片技術(shù)

1、半薄超薄切片技術(shù)第1頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二背景：肉眼光學(xué)顯微鏡透射電鏡分辨率0.2mm0.2m0.2nm應(yīng)用范圍可觀察頭發(fā)絲、雙面刀刀刃的厚度可觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)(最大有效倍數(shù):1000)可觀察細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu),分辨DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子、單個(gè)金屬原子（放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍）觀察半薄切片觀察超薄切片第2頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二半薄切片超薄切片？第3頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二一、超薄切片技術(shù)介紹第4頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二固定地好滲透包埋地好切地好載網(wǎng)膜做地好染地好 超薄切片的基本要

2、求:第5頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二超薄切片主要步驟取材固定漂洗、脫水滲透、包埋超薄切片超薄切片染色每一步都是關(guān)鍵,任何環(huán)節(jié)的疏忽都會導(dǎo)致制片的失敗第6頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二1 取材 1.1 取材的基本要求 (1)動作迅速，取材后快速放入固定液中；(2)體積要小，一般13，如果來不及，例如野外取材，也可將組織修成（112）mm大小長條形，之后再進(jìn)行分割。 (3)減小損傷，切割器械鋒利，操作輕，避免牽拉、挫傷與擠壓組織。(4)低溫操作，最好在低溫(04)下進(jìn)行，降低酶的活性。所用器具和固定液都應(yīng)預(yù)冷。 (5)取材部位要準(zhǔn)確。第7頁，共46

3、頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二1.2 取材方法 材料放在潔凈的韌性較大的紙上 滴上預(yù)冷的固定液 用刀片將組織切下并修小 用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有預(yù)冷的固定液的小瓶中。植物材料的取材可以先切成薄片，經(jīng)適當(dāng)固定后再切成小方塊繼續(xù)固定。 第8頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二2 固定 (抽氣)2.1固定的目的 采用物理、化學(xué)等方法迅速殺死細(xì)胞的過程稱之為固定。 目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，牢固地固定在它們原來所在的位置上，不發(fā)生位移。 良好的固定是獲得精細(xì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)圖象的關(guān)鍵。第9頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，

4、星期二2.2 常用固定劑 (1)四氧化鋨 (OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，可較好的固定脂肪、蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白；固定變性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原；具有固定和電子染色雙重作用，樣品圖象反差較好；酶的鈍化劑，不適合細(xì)胞化學(xué)的固定；與乙醇/醛類反應(yīng)生產(chǎn)沉淀漂洗分子較大,滲透速度緩慢,但反應(yīng)迅速,均勻固定深度0.25；固定時(shí)間一般為1-2小時(shí),時(shí)間太長易使組織變脆,切片困難；鋨酸固定液常用濃度：12; 極易揮發(fā)，對粘膜、角膜毒性極大,操作要十分小心!第10頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二(2)戊二醛 (

5、 C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存組織細(xì)微結(jié)構(gòu),對蛋白質(zhì)的固定效果好；滲透力強(qiáng),滲透速度快,較好的固定糖原、核蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)、有絲分裂的紡錘絲及胞飲小泡等；保存某些酶的活力,較好保存抗原,適于細(xì)胞化學(xué)研究；對組織和細(xì)胞的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，均勻固定深度:0.51mm ,04可長時(shí)間固定(幾周甚至12個(gè)月)不會使組織變脆，可用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的取材;缺點(diǎn):不能保存脂肪，磷脂固定效果差，對細(xì)胞膜的顯示較差，沒有電子染色作用。 第11頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二(3)甲醛-Formaldehyde 滲透組織的能力比戊二醛強(qiáng)，對于致密組織（種子

6、）固定作用好；細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存質(zhì)量不如戊二醛，但酶活性的保存優(yōu)于戊二醛；缺點(diǎn)：不能較好的固定細(xì)胞基質(zhì)，脫水后大部分細(xì)胞基質(zhì)將丟失；常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。第12頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二(4)高錳酸鉀強(qiáng)氧化劑，較好固定脂蛋白;對神經(jīng)髓鞘、葉綠體及其他各種膜結(jié)構(gòu)的研究均可作為固定劑；只用于某些常用固定劑難以固定的植物和酵母樣品，且一般不需要用鋨酸后固定.第13頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二3漂洗、脫水3.1漂洗漂洗的目的:組織固定后脫水前的漂洗: 清除殘留固定劑,減小固定劑和脫水劑之間的反應(yīng)，避免沉淀物干擾超微結(jié)構(gòu)的觀察.雙重固定中,在

7、鋨酸固定前的漂洗: 避免鋨酸與戊二醛反應(yīng)生成細(xì)小而致密的餓沉淀，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu).第14頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二常 用 緩沖液優(yōu) 點(diǎn)缺 點(diǎn) pH磷酸鹽緩沖液對細(xì)胞無毒性作用,緩沖能力強(qiáng)固定時(shí)易產(chǎn)生沉淀,易長細(xì)菌植物材料一般6.87.2二甲砷酸鹽緩沖液不易長細(xì)菌,與低濃度鈣質(zhì)1-3mM不發(fā)生沉淀反應(yīng)有毒(通風(fēng)櫥)醋酸巴比妥緩沖液固定時(shí)不產(chǎn)生沉淀易長細(xì)菌,只適于配鋨酸固定液,不適合配醛類(緩沖失效)第15頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二3.2 脫水目的 將組織內(nèi)的游離水徹底清除,保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部。方法 用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來

8、取代水,常用的脫水劑是乙醇和丙酮。第16頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二注意事項(xiàng)脫水梯度逐級進(jìn)行, 急劇脫水會引起細(xì)胞收縮。（ 30% 50%70%80%95%100%100%）;更換溶液動作要快。長時(shí)間暴露空氣中會在組織內(nèi)外產(chǎn)生微小氣泡，影響滲透；脫水過程中應(yīng)在70%脫水劑中4停留或過夜,過度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提，而且會使樣品發(fā)脆，造成切片困難;置換用脫水劑：環(huán)氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蠟）。第17頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二4 滲透和包埋、聚合4.1滲透滲透就是利用包埋劑滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑的過程。 包埋劑在單體狀態(tài)時(shí)(聚

9、合前)為液體，能夠滲入組織內(nèi)，當(dāng)加入某些催化劑，經(jīng)加溫或其他條件，能聚合成固體，以便進(jìn)行超薄切片。第18頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二4.2 包埋、聚合 包埋操作： 將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中或膠囊中，一定條件下可聚合硬化，形成包埋塊。包埋板1包埋管膠囊第19頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二常用的包埋劑第20頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二Epon812滲透效果好，切片的圖像對比度強(qiáng)，電子束照射下穩(wěn)定吸潮性很強(qiáng)，潮濕和炎熱的環(huán)境下，樹脂會變軟Spurr黏度低，可較好地滲透具有硬的木質(zhì)化細(xì)胞壁的植物細(xì)胞、脂肪含量很高的內(nèi)胚

10、乳、高度液泡化的成熟果實(shí),電子束照射下穩(wěn)定圖像對比度較弱Araldite聚合均勻，收縮量很小，超薄切片可直接沾在沒有支持膜的載網(wǎng)上，電子束照射下十分穩(wěn)定，用重金屬染色時(shí)易著色。環(huán)氧樹脂(epoxy resin)第21頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二水溶性樹脂丙烯酸類樹脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，適于進(jìn)行組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)研究的樣品制備。 適于低溫包埋，通常用于免疫電鏡樣品的制備。第22頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二 包埋操作中的注意事項(xiàng)所有試劑要防潮，最好存放在干燥器中；所用器皿應(yīng)烘干；配包埋劑時(shí)，每加入一種試劑

11、要攪拌均勻；包埋時(shí)動作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；盛放過包埋劑的容器要及時(shí)用丙酮清洗干凈.皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；第23頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二5 超薄切片5.1修塊削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形，每邊的長度為0.2mm0.3mm。第24頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二5.2 超薄切片 超薄切片機(jī)：LEICA ULTRACUT R超薄切片厚度: 100nm,一般 50-70nm第25頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二5.3 載網(wǎng)和支

12、持膜載網(wǎng)(超薄) 載網(wǎng)銅網(wǎng)(常用)不銹鋼網(wǎng)鎳網(wǎng)(免疫電鏡)第26頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二直徑：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm 第27頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二5.3 載網(wǎng)和支持膜 (2) 載網(wǎng)支持膜膜的要求:透明無結(jié)構(gòu),并能承受電子束的轟擊.支持膜的種類: 火棉膠膜 聚乙烯醇縮甲醛膜(formvar膜) 碳膜膜的厚度:10nm20nm第28頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二6 超薄切片的染色目的: 增強(qiáng)樣品的反差,提高圖象的清晰度.常用染色劑: 重金屬鹽 各種染料第29頁，共46頁，2022年，5月20日，

13、2點(diǎn)5分，星期二常用的染色劑: 醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法：(1) 組織塊染色 在脫水至70%乙醇時(shí)，將組織塊放在用70%乙醇配制的飽和醋酸鈾溶液中，染色時(shí)間2小時(shí)以上，或在冰箱中過夜。超薄切片染色第30頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二(2)超薄切片后染色醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染鈾染:細(xì)胞核及結(jié)締組織染色鉛染:提高細(xì)胞質(zhì)成分的反差第31頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二1）前固定（固定液體積是固定材料的十倍以上，材料不堆積）3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室溫5-6h，后4C保存2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4

14、次，20-30Min/次3）后固定1%鋨酸固定 in 0.1M PBS，4C overnight4）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次5）系列脫水：30%-50%-70%（4C, overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%）用丙酮置換乙醇：乙醇:丙酮=1:1，純丙酮2次， 每級20-30分鐘6）滲透丙酮:樹脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/級純樹脂12h，換純樹脂12h （從進(jìn)入樹脂開始更要嚴(yán)格防潮?。?）包埋聚合 60C 24hr注意：免疫電鏡時(shí)不用鋨酸固定，樹脂換成LRWhite等水

15、溶性樹脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2第32頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二超薄切片圖片第33頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二二、半薄切片技術(shù)介紹第34頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二半薄切片主要步驟取材固定漂洗、脫水滲透、包埋半薄切片半薄切片染色每一步都是關(guān)鍵,任何環(huán)節(jié)的疏忽都會導(dǎo)致制片的失敗第35頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二FAA固定液（福爾馬林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蠟切片一般固定根、莖、葉、花藥、子房組織切片。幼嫩材料用50

16、%酒精代替70%酒精，防止材料收縮；加入5%甘油可防固定液蒸發(fā)和材料變硬。第36頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二卡諾固定液 12純酒精15ml30ml氯仿5ml 冰醋酸5ml1ml滲透迅速，固定根尖和花藥只需30-60分鐘，但固定時(shí)間不能太久，一般不超過一天第37頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二切片厚度：0.55um切片撈到載玻片上半薄切片第38頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二半薄切片染色染色方法現(xiàn) 象番紅固綠對染法木質(zhì)化的細(xì)胞壁及細(xì)胞核紅纖維素的細(xì)胞壁及細(xì)胞壁綠鐵礬蘇木精法細(xì)胞一般結(jié)構(gòu)及細(xì)胞分裂時(shí)期的優(yōu)良染劑，細(xì)胞分裂時(shí)期的染色體染成黑色高碘酸席夫反應(yīng)法（PAS法）植物組織染成不同程度的紅色，可將纖維素細(xì)胞壁及淀粉粒染成紅色第39頁，共46頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)5分，星期二染料介紹細(xì)胞壁的染料酸性品紅 番紅 固綠 甲苯胺藍(lán) 蘇木精 結(jié)晶紫 亮綠 蘇丹IV細(xì)胞核染料（堿性）堿性品紅 蘇木精 洋紅 番紅 地衣紅 結(jié)晶紫 細(xì)胞質(zhì)染料（酸性）酸性品紅 甲苯胺藍(lán) 曙紅 固綠 苦味酸各種熒光染料染色原則：先用堿性染料染再用酸性染料染第40頁，共46頁，20