抗癲疒間藥物誘導(dǎo)對(duì)血腦屏障上P糖蛋白功能與表達(dá)的影響

1、抗癲疒間藥物誘導(dǎo)對(duì)血腦屏障上P-糖蛋白功能與表達(dá)的影響【摘要】目的研究長(zhǎng)期使用抗癲疒間藥物(AEDs)對(duì)大鼠腦中P-糖蛋白(P-gp)功能活性和表達(dá)程度的影響。方法選擇苯巴比妥、苯妥英鈉和卡馬西平三個(gè)典型AEDs，在大鼠體內(nèi)連續(xù)給藥21天，然后觀察腦組織中皮質(zhì)和海馬P-gp的改變。結(jié)果底物羅丹明123轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)說明P-gp功能增強(qiáng)，進(jìn)一步通過esternBlt分析說明P-gp表達(dá)增強(qiáng)，并用免疫組化染色顯示其細(xì)胞定位在血腦屏障上。結(jié)論長(zhǎng)期AEDs誘導(dǎo)可以同時(shí)導(dǎo)致大鼠血腦屏障上P-gp功能活性和表達(dá)程度的升高?！娟P(guān)鍵詞】P-糖蛋白;血腦屏障;抗癲疒間藥物;誘導(dǎo)Abstrat:bjetiveTinve

2、stigatehetherhrniexpsurefantiepileptidrugs(AEDs)inreasedP-glyprtEin(P-gp)funtinandexpressininbrainfrats.ethdsThreedrugsphenbarbital(PB),phenytin(PHT)andarbaazepine(BZ)ererallygiventratsfrsuessive21days,P-gpativityandlevelsinbrainasassessed.ResultsTissue-t-plasanentratinratisfRh123eresignifiantlydere

3、asedinerebralrtexandhippapus.Iunhistheistryresultshedthatup-regulatinftheP-gpainlyurredinapillaryendthelialvessels.esternbltresultsuggestedthattheprtEInlevelfP-gpinrtexandhippapusfratsexpsedtdrugsassignifiantlyhigherthanthatfntrlrats.nlusinhrniexpsurefAEDsayinreaseP-gpfuntinandlevelinbrainfrats.Keyr

4、ds:P-glyprtein;Bld-brainbarrier;Antiepileptidrugs;Indutin癲疒間是一種慢性神經(jīng)性疾病，患者中約有30%為難治性癲疒間，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，成為一個(gè)醫(yī)學(xué)難題。越來越多的研究證明，難治性癲疒間患者腦內(nèi)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)上調(diào)，如P-糖蛋白(P-glyprtein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(ultidrugresistaneprtein，RP)等1-2。血腦屏障主要由單層腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，調(diào)節(jié)和保護(hù)大腦微環(huán)境。P-gp是血腦屏障上一種重要的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，許多藥物包括一些抗癲疒間藥物(antiepileptidrugs，AEDs)都是它的

5、底物3-4。有研究發(fā)現(xiàn)AEDs誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brainirvasularendthelialells，BEs)中P-gp表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，且呈劑量和時(shí)間依賴性5。因?yàn)锽Es是構(gòu)成血腦屏障(bld-brainbarrier，BBB)的主要形態(tài)學(xué)根底，那么為了證實(shí)AEDs是否也會(huì)對(duì)BBB上的P-gp產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，且其是否是癲疒間患者長(zhǎng)期用藥后出現(xiàn)治療失敗的原因之一，本實(shí)驗(yàn)討論長(zhǎng)期使用AEDs是否可以誘導(dǎo)大鼠腦中P-gp功能活性和表達(dá)程度的上調(diào)。1材料和方法1.1藥品與試劑羅丹明123標(biāo)準(zhǔn)品(rhdaine123，Rh123)購(gòu)自美國(guó)Siga公司;甲醇為色譜純(美國(guó)FisherIn.

6、);苯巴比妥(phenbarbital，PB)購(gòu)自上海新亞藥業(yè);苯妥英鈉(phenytinsdiu，PHT)購(gòu)自天津力生制藥股份;卡馬西平(arbaazepine，BZ)購(gòu)自上海三維制藥;鼠anti-P-gp一抗(219，IgG)購(gòu)自美國(guó)albihefEDBisienesIn.;IRDyeT800抗鼠IgG二抗購(gòu)自美國(guó)RklandIn.;鼠anti-atin單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)BsterBiteh公司;其余試劑均為市售分析純。1.2儀器L-10ADVP高效液相色譜儀，RF-10AXL熒光檢測(cè)器(日本Shiadzu);5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendrf);61型電泳儀(北京六一儀器

7、廠);半干轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠);6131型核酸、蛋白質(zhì)含量測(cè)定儀(德國(guó)EppendrfIn.)。1.3動(dòng)物與分組安康雄性Sprague-Daley大鼠，體重180200g，由中國(guó)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SXK(蘇)2002-0011。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)施行。動(dòng)物隨機(jī)分組，每組6只，苯巴比妥組給予苯巴比妥15g/kg，苯妥英鈉組給予苯妥英鈉25g/kg，卡馬西平組給予卡馬西平50g/kg，正常對(duì)照組給予等體積的羧甲基纖維素鈉，給藥體積為1l/100g。每天灌胃給藥2次，連續(xù)給藥21天。1.4方法1.4.1P-gp功能分析給藥周期完畢后，AEDs誘導(dǎo)組大鼠與正

8、常對(duì)照組大鼠靜脈注射Rh1230.2g/kg(臨用前以生理鹽水配制成0.1g/L，給藥體積為2l/kg)，60in后股動(dòng)脈取血(約3l)于肝素化試管中，立即斷頭處死大鼠，剝?nèi)∧X皮質(zhì)與海馬。血液離心(4000r/in，5in)后取上層血漿，采用甲醇沉淀蛋白，通過HPL-FLD進(jìn)展血漿、腦皮質(zhì)與海馬中Rh123濃度測(cè)定，詳細(xì)條件如下：流動(dòng)相為乙腈-水相(1乙酸，2三乙胺)=4060，流速1l/in，檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex485n，E546n，以腦皮質(zhì)/血漿、海馬/血漿的濃度比值進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。1.4.2免疫組織化學(xué)染色給藥周期完畢后，AEDs誘導(dǎo)組大鼠與正常對(duì)照組大鼠用乙醚麻醉后立即斷頭處死，剝?nèi)∧X皮質(zhì)與海

9、馬。相對(duì)于前囟點(diǎn)-0.8、-3.8分別取含皮質(zhì)、海馬構(gòu)造的23厚腦塊(冠狀切面)，置福爾馬林溶液中梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化后，加50l過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10in，PBS沖洗3in3次;加50l正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10in;加100l一抗(1100稀釋)，37孵育60in;加50l二抗(1100稀釋)，室溫下孵育10in，PBS沖洗3in3次;加50l鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10in，PBS沖洗5in3次;DAB顯色，脫水，透明，封片。切片在lypus-Vanx顯微鏡下觀察并照相，照片導(dǎo)入IagePr-Plus顯

10、微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)展數(shù)據(jù)分析，選定陽(yáng)性細(xì)胞后獲得光密度(D值)表示P-gp免疫反響強(qiáng)度。1.4.3蛋白印跡檢測(cè)P-gp表達(dá)定量稱取大鼠腦皮質(zhì)、海馬，參加haps裂解液冰浴裂解1h，離心取上清液;膜蛋白液經(jīng)核酸定量?jī)x測(cè)定后100、5in變性;參加4ladingbuffer上樣，100V電泳2.5h;轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉37封閉1h;PBST清洗10in3次，參加一抗219(1200)37孵育1h，4過夜;PBST清洗10in3次，參加二抗(15000)37孵育1h;PBST清洗10in3次，顯影。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展處理，各組數(shù)據(jù)均以s表示。各組數(shù)據(jù)總體差異的比擬采用單

11、因素方差分析(ne-ayANVA)，組間兩兩比擬采用q檢驗(yàn)，P0.05為差異有顯著性。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1P-gp功能的變化本實(shí)驗(yàn)使用經(jīng)典的P-gp底物Rh123對(duì)P-gp的功能活性進(jìn)展分析，結(jié)果見表1。21天的AEDs給藥導(dǎo)致Rh123在腦皮質(zhì)和海馬中的濃度降低，而血漿中的濃度未見明顯變化，使得Rh123腦皮質(zhì)/血漿濃度比、海馬/血漿濃度比顯著降低。BZ、PHT、PB組腦皮質(zhì)/血漿濃度比擬正常對(duì)照組顯著下降(P0.05或P0.01)，PHT、PB組海馬/血漿濃度比擬正常對(duì)照組顯著下降(P0.01)，而BZ組無明顯差異(P0.05)。表1Rh123在腦皮質(zhì)和海馬中分布的變化：腦皮

12、質(zhì);H：海馬;P：血漿;與正常對(duì)照組比擬：*P0.05，*P0.012.2免疫定位與反響強(qiáng)度的變化P-gp抗體219的免疫定位主要位于組成血腦屏障的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞頂膜上，陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色。通過進(jìn)一步半定量分析免疫反響強(qiáng)度(D值)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期BZ、PB和PHT誘導(dǎo)的大鼠，腦皮質(zhì)的D值均高于正常對(duì)照組大鼠，但無顯著性差異，按D值大小排列：PB組BZ組PHT組正常對(duì)照組;海馬的D值均高于正常對(duì)照組大鼠，且均具有顯著性差異(P0.05)，按D值大小排列：PHT組BZ組PB組正常對(duì)照組(同一張切片，在高倍鏡下任取3個(gè)觀察視野，獲得的D值取平均值作為一個(gè)動(dòng)物的數(shù)據(jù))。見圖1。2.3P-gp表達(dá)的變化e

13、sternBlt分析顯示，P-gp在AEDs誘導(dǎo)大鼠腦皮質(zhì)中有較高表達(dá)，與正常對(duì)照組大鼠比擬，BZ、PHT、PB組表達(dá)的增加具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);P-gp在AEDs誘導(dǎo)大鼠海馬中也有較高表達(dá)，表現(xiàn)與腦皮質(zhì)中相似的變化趨勢(shì)，與正常對(duì)照組大鼠比擬，BZ、PHT、PB組表達(dá)的增加具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。見圖2。3討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，AEDs長(zhǎng)期誘導(dǎo)過程可能有促使大鼠不同腦區(qū)上P-gp表達(dá)上調(diào)的作用;而在P-gp功能活性分析中，AEDs誘導(dǎo)可以顯著降低大鼠Rh123腦皮質(zhì)/血漿比、海馬/血漿比，說明AEDs誘導(dǎo)可能同時(shí)引起P-gp表達(dá)和活性的增強(qiáng)。在這些AEDs中，PHT顯示最強(qiáng)的P-gp誘導(dǎo)作用，包括P-gp表達(dá)程度的誘導(dǎo)和P-gp功能活性的誘導(dǎo)。BZ誘導(dǎo)大鼠海馬的P-gp表達(dá)和功能的變化之間存在一定的差異，BZ誘導(dǎo)大鼠的海馬表現(xiàn)出比正常對(duì)照組大鼠更高的P-gp表達(dá)程度和免疫反響強(qiáng)度，但P-gp的功能活性與正常對(duì)照組大鼠相似。這一現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道，en等6的實(shí)驗(yàn)稱BZ可能不是P-gp的底物，不影響Rh123的外排;但BZ卻可以在外周血淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)7，此現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制在文獻(xiàn)中仍不明