【課件】第四章RQ補料發(fā)酵終點7版

1、【課件】第四章RQ補料發(fā)酵終點7版【課件】第四章RQ補料發(fā)酵終點7版 第六節(jié) 二氧化碳和呼吸商 1. 二氧化碳對發(fā)酵的影響二氧化碳是細胞代謝的可貴指示。通過碳質(zhì)量平衡來估算生長速率和細胞量。二氧化碳對氨基酸、抗生素等微生物發(fā)酵具有抑制或刺激作用。 A 二氧化碳對菌體生長及產(chǎn)物形成的影響當排出的二氧化碳CO2濃度高于4%時，碳水化合物的代謝及微生物的呼吸速率下降。當二氧化碳分壓為0.08105Pa時，青霉素合成速率會降低40%。發(fā)酵液中溶解二氧化碳濃度為1.6102mol時，會嚴重抑制酵母菌的生長。 第六節(jié) 二氧化碳和呼吸商【課件】第四章RQ補料發(fā)酵終點7版當二氧化碳分壓為0.0042105Pa

2、時，四環(huán)素的生物合成處于最佳狀態(tài)。 CO2會影響產(chǎn)黃青霉菌的形態(tài) 當二氧化碳分壓為0.0042105Pa時，四環(huán)素的生物合成二氧化碳及HCO3都會影響細胞膜的結構。它們分別作用于細胞膜的不同位點。 溶解于培養(yǎng)液中的二氧化碳主要作用在細胞膜的脂肪酸核心部位， 而HCO3則影響磷脂、親水頭部帶電荷表面及細胞膜表面上的蛋白質(zhì)。 當細胞膜的脂質(zhì)相中二氧化碳濃度達一臨界值時，使膜的流動性及表面電荷密度發(fā)生變化，這將導致許多基質(zhì)的膜運輸受阻，影響了細胞膜的運輸效率，使細胞處于“麻醉”狀態(tài)，細胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生了改變。二氧化碳及HCO3都會影響細胞膜的結構。它們分別作用于細胞10米高的罐中，在1.01

3、105Pa氣壓下操作，底部二氧化碳分壓是頂部二氧化碳分壓的二倍。10米高的罐中，在1.01105Pa氣壓下操作，底部二氧化B 排氣二氧化碳濃度與菌體量、pH、排氣氧之間的關系 a 檢測菌體生長菌體生長速率與二氧化碳釋放率(CER)成比例關系。菌量產(chǎn)率YX/CO2為30.2ggCO2.B 排氣二氧化碳濃度與菌體量、pH、排氣氧之間的關系從測定排氣二氧化碳濃度變化，采用控制流加基質(zhì)的方法來實現(xiàn)對菌體的生長速率和菌體量的控制。從測定排氣二氧化碳濃度變化，采用控制流加基質(zhì)的方法來實現(xiàn)對菌b 補糖與排氣二氧化碳、pH變化關系在青霉素發(fā)酵中補糖將引起排氣二氧化碳濃度的增加和培養(yǎng)液pH下降見圖933。所產(chǎn)生

4、的二氧化碳可以用青霉素產(chǎn)生菌的生長和產(chǎn)物形成的化學簡式來說明，見式(9-26)，式(9-27)，式(9-28)?？梢?，隨著糖耗的增加，CER也增加。 菌體生長 C6H12O6十NH3十3.3O2十0.06H2SO4 0.42C71H13.2O4.4NS0.06十3CO2十4.8H2O (9-26) 菌體維持 C6H12O6十6O2 6CO2十6 H2O (9-27) 青霉素生產(chǎn) C6H12O6十(NH4)2SO4十0.5O2 十PAA C16H17O4N2S十2CO2十H2O (9-28) b 補糖與排氣二氧化碳、pH變化關系 從圖933中看出，由于葡萄糖的補入，排氣二氧化碳增加，同時pH下降

5、。其原因主要有兩個方面，一是葡萄糖被菌利用產(chǎn)生二氧化碳，溶于培養(yǎng)液使pH下降二是葡萄糖被菌利用過程產(chǎn)有機酸，使pH下降。糖、CO2、pH三者的相關性，被青霉素工業(yè)生產(chǎn)上用于補料控制的參數(shù)，并認為排氣二氧化碳的變化比pH變化更為敏感；所以以測定排氣CO2釋放率來控制補糖速率。從圖933中看出，由于葡萄糖的補入，排氣二氧化碳增加，同時C 排氣二氧化碳濃度和排氣氧濃度的相關性 由式(9-26)一式(9-28)可知，菌體耗糖形成二氧化碳時，必須提供作為生物氧化所需 氧，因此在排氣成分分析中，可以很明顯得到氧濃度降低和二氧化碳濃度升高的對應曲線，其相關深度可用呼吸商RQ來表示。 C 排氣二氧化碳濃度和排

6、氣氧濃度的相關性2. 呼吸商與發(fā)酵的關系發(fā)酵過程中菌的耗氧速率(OUR)可通過熱磁氧分析儀或質(zhì)譜儀測量進氣和排氧中的氧含量計算而得， 過程中氧含量的變化恰與二氧化碳含量變化成反向同步關系，并由此看出菌的生長，呼吸情況，和求出菌的呼吸商RQ值， RQCEROUR。 RQ可以反映菌的代謝情況。2. 呼吸商與發(fā)酵的關系如酵母發(fā)酵過程RQ1，表示糖代謝走有氧分解代謝途徑，僅生成菌體，無產(chǎn)物形成；如RQ1.l，表示走EMP途徑，生成乙醇；RQ0.93，生成檸檬酸；RQ0.7，表示生成的乙醇被當作基質(zhì)利用。 菌在利用不同基質(zhì)時，RQ值也不相同。如大腸桿菌以延胡索酸為基質(zhì)，RQ為1.44；丙酮酸RQ為1.2

7、6，琥珀酸RQ為1.12；乳酸、葡萄糖RQ為1.02和1.00；乙酸 RQ為0.967甘油RQ為0.80。 如酵母發(fā)酵過程RQ1，表示糖代謝走有氧分解代謝途徑，僅生成在抗生素發(fā)酵中，由于存在菌體生長、維持以及產(chǎn)物形成的不同階段，其RQ值也不一樣。如青霉素發(fā)酵中的理論呼吸商為 菌體生長，RQ0.909； 菌體維持，RQ1； 青霉素生產(chǎn)，RQ4。 在抗生素發(fā)酵中，由于存在菌體生長、維持以及產(chǎn)物形成的不同階段從上述情況來看，在發(fā)酵早期主要是菌體生長，RQ低于1；在過渡時期，由于菌體維持其生命活動及青霉素逐漸形成，基質(zhì)葡萄糖的代謝不是僅用于生長菌體，(如式9- 27)此時RQ比生長期略有增加；產(chǎn)物形成

8、時RQ達最高；產(chǎn)物形成對RQ的影響較為明顯。如果產(chǎn)物的還原性比基質(zhì)大時，其RQ值就增加；反之，當產(chǎn)物的氧化性比基質(zhì)大時，RQ值就要減少。其偏離程度決定于每單位菌體利用基質(zhì)所形成的產(chǎn)物量。從上述情況來看，在發(fā)酵早期主要是菌體生長，RQ低于1；二氧化碳和呼吸商復習題1,二氧化碳對發(fā)酵有何影響2,二氧化碳影響細胞的什么部位,使細胞處于什么狀態(tài).3,排氣二氧化碳濃度與菌體量、pH、排氣氧之間有什么關系.4,什么叫呼吸商,呼吸商如何反映代謝情況.二氧化碳和呼吸商復習題1,二氧化碳對發(fā)酵有何影響 第八節(jié) 基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響及補料控制 1. 基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響 在分批發(fā)酵期間，有一種與Iangmur單分

9、子吸附等溫線相似的模型，用以描述基質(zhì)濃度與生長速率的關系，稱為monod模型，見式(9-30) (930)。 式中 比生長速率h1 最大比生長速率； S基質(zhì)濃度； Ks飽和常數(shù)，是在0.5時的基質(zhì)濃度。 第八節(jié) 基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響及補料控制【課件】第四章RQ補料發(fā)酵終點7版a.底物的反饋抑制作用 由以上線段C可知當?shù)孜餄舛容^高時就會產(chǎn)生底物的反饋抑制作用,隨著底物濃度的增加,比生長速率反而下降.b.細胞脫水作用葡萄糖濃度低于100150gL，不會出現(xiàn)生長的抑制，但當濃度超過350600gL時，多數(shù)生物不能生長，在這種濃度下會使細胞脫水。只有嗜滲性的生物能在這樣高濃度的溶液中生長。 a.底物的

10、反饋抑制作用c.高濃度基質(zhì)會引起碳分解代謝物阻遏現(xiàn)象阻礙了產(chǎn)物的形成。例如，在葡萄糖氧化酶(GOD)發(fā)酵中，以葡萄糖為碳源，它對GOD的形成具有雙重效應，即低濃度下有誘導作用而高濃度下有分解代謝物阻遏作用。試驗結果表明葡萄糖的代謝中間物，如檸檬酸三鈉、琥珀酸鈉、蘋果酸鈣和丙酮酸鈉，對GOD的形成有明顯的抑制作用。因此，降低葡萄糖用量，從8%降至6%，補入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分別提高26%或6.7%，能部分解除由高濃度葡萄糖所產(chǎn)生的分解代謝物的阻遏作用。c.高濃度基質(zhì)會引起碳分解代謝物阻遏現(xiàn)象2. 補料控制 解除基質(zhì)過濃的抑制 產(chǎn)物的反饋抑制 和葡萄糖分解阻遏效應 避免在分批發(fā)酵中因一次

11、性投糖過多造成細胞大量生長，耗氧過多而供氧不足的狀況 近年來從補料方式到計算機最優(yōu)化控制等都取得較大進展。就補料方式而言，有連續(xù)流加和變速流加。每次流加又可分為2. 補料控制 快速流加、 恒速流加、 指數(shù)速率流加 變速流加。 從補加的培養(yǎng)基成分來區(qū)分，又可分成 單一組分補料和 多組分補料等等。蠕動泵 蠕動泵選擇恰當?shù)姆答伩刂茀?shù)進行中間補料了解這些參數(shù)對于微生物代謝、菌體生長、基質(zhì)利用以及產(chǎn)物形成之間的關系。補料程序依賴于比生長曲線、菌體形態(tài)、產(chǎn)物生成速率及發(fā)酵的初始條件等的情況。選擇恰當?shù)姆答伩刂茀?shù)進行中間補料反饋控制操作非直接方法 以溶氧、pH、呼吸商、排氣中二氧化碳分壓及代謝物質(zhì)濃度等

12、作為反饋控制參數(shù)。直接方法 直接以限制性營養(yǎng)物濃度作為反饋控制參數(shù)，例如 控制氮源、碳源或碳、氮比等方式。目前只有少數(shù)基質(zhì)，如甲醇、乙醇、葡萄糖能直接測量。由于缺乏能直接測量重要參數(shù)的傳感器，因此直接方法的使用受到了限制。反饋控制操作建立分批補料培養(yǎng)的數(shù)學模型及選擇最佳控制程序在谷氨酸發(fā)酵過程中，生產(chǎn)菌的攝氧率和基質(zhì)消耗速率之間在生長某一階段存在著線性關系。根據(jù)這種關系，補料的聯(lián)機控制可通過攝氧率來執(zhí)行。可將補料速率控制在與基質(zhì)利用速率相等的狀態(tài)。測出分批加糖過程中排氣氧濃度，計算攝氧率(OUR)，與糖耗速率(qsX)之間的線性關系式如下：建立分批補料培養(yǎng)的數(shù)學模型及選擇最佳控制程序在谷氨酸發(fā)

13、酵過程(931) 利用K值和攝氧率可間接估算糖耗。從理論上按反應式(9-31)計算可得K值似應為1.5。C6H12O6十1.5O2+NH3 C2H9O4N+CO2十H2O (9-32)根據(jù)攝氧率與糖耗速率之間的線性關系制定的加糖模型控制在加糖時發(fā)現(xiàn)，最佳K值應為1.75。(931) 利用K值和攝氧率可間接估算糖耗。從理論上按 圖9-35所示三批谷氨酸發(fā)酵中K值對控制糖濃度的影響。K1.51時，糖耗估計過高，發(fā)酵罐中糖過量；而K2.16時，糖耗估計又過低；K1.75 時，加糖速率等于糖耗速率。 圖9-35所示三批谷氨酸發(fā)酵中K值對控制糖濃度的影響。 表912 連續(xù)補料和分批補料發(fā)酵的比較項 目連

14、續(xù)法分批法批數(shù)加糖總量g殘?zhí)?L(以最終體積算)發(fā)酵時間h最終谷氨酸濃度糖轉(zhuǎn)化率g/g4190393.323.095.20.5044139424.69790.80.479在30L發(fā)酵罐中進行了計算機控制系統(tǒng)與常規(guī)分批加糖方法的比較研究，其結果盡表9-12。實驗證明，以估算糖耗為基礎的連續(xù)加糖法可縮短發(fā)酵周期，而且最終谷氨酸濃度和轉(zhuǎn)換率比分批加糖法高。 表912 連續(xù)補料和分批補料發(fā)酵的比較批養(yǎng)分或前體比吸收速率所需補料速率已糖NH3PO43SO42苯乙酸0.33 mmolg-1h-1 1.6(最適)mmolg-1h-11.2在0.015 h-19.0mg g-1h-1o.6mg g-1h-19

15、.8mg g-1h-11.8mg g-1h-113.2mm01L-1h-1 64.0mm01L-1h-180mgL-1h-121mg g-1h-1112.0mg g-1h-172.0mg g-1h-1表913產(chǎn)黃青霉菌突變株的各種養(yǎng)分比吸收速率已糖0.33 mmolg-1h-1 1.6(最適)mmoBajpa等選用一套生長、青霉素生產(chǎn)、基質(zhì)和氧消耗的模型，用這模型來優(yōu)化恒定的補糖速率和KLa和青霉素的補糖速率，如圖9-36，補糖速率的最佳點與設備的供氧能力有關，KLa大的，補料速率相應也大，同時生產(chǎn)水平也高。供氧能低的設備(KLa80h-1)補料速率也相應的要減少，才能達到在這一設備中生產(chǎn)的最

16、高水平。但其產(chǎn)量要比供氧能力好的設備降低23%。 Bajpa等選用一套生長、青霉素生產(chǎn)、基質(zhì)和氧消耗的模型，用補料蠕動泵酸堿調(diào)節(jié)泵補料蠕動泵酸堿調(diào)節(jié)泵 控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分 次級代謝產(chǎn)物的生成大多與快速被利用碳源(主要是葡萄糖)的消耗密切相關。只有在葡萄糖幾乎耗盡，生長停止時，才開始大量合成次級代謝產(chǎn)物。 避免葡萄糖效應 常采用 混合碳源培養(yǎng)基 流加葡萄糖 控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分實例1 避免葡萄糖效應在發(fā)酵過程中的應用 補糖與排氣二氧化碳、pH變化關系 在青霉素發(fā)酵中補糖將引起排氣二氧化碳濃度的增加和培養(yǎng)液pH下降。所產(chǎn)生的二氧化碳可以用青霉素產(chǎn)生菌的生長和產(chǎn)物形成的化學簡式來說明，見下式，隨著

17、糖耗的增加，CER也增加。 菌體生長 C6H12O6十NH3十3.3O2十0.06H2SO4 0.42C71H13.2O4.4N0.06S十3CO2十4.8H2O 菌體維持 C6H12O6十6O2 6CO2十6 H2O 青霉素生產(chǎn) C6H12O6十(NH4)2SO4十0.5O2 十PAA C16H17O4N2S十2CO2十H2O實例1 避免葡萄糖效應在發(fā)酵過程中的應用 葡萄糖的補入，排氣二氧化碳增加，pH下降。原因有兩個方面一是葡萄糖被菌利用產(chǎn)生二氧化碳，其中溶解的二氧化碳使培養(yǎng)液pH下降另一方面葡萄糖被菌利用過程中產(chǎn)生有機酸，使pH下降。糖、CO2、pH三者有相關性，被青霉素工業(yè)生產(chǎn)上用于補

18、料控制的參數(shù)，排氣二氧化碳的變化比pH變化更為敏感。 葡萄糖的補入，排氣二氧化碳增加，pH下降。原因有兩個pH時間/hrpH時間/hr實例3 基因工程菌畢赤酵母高密度高表達發(fā)酵過程GS115宿主菌染色體上AOX1基因被外源基因替代示意圖HAS-1(Mut+)表達rh-SA發(fā)酵過程細胞密度和表達水平曲線特點:甲醇作唯一能源和碳源的特性，外源基因插在能夠利用甲醇的AOX基因中，甲醇誘導醇氧化酶來利用甲醇，同時啟動表達外源基因的AOX的啟動子(PAOX)表達外源基因蛋白，因此在外源表達階段只有用甲醇來誘導。實例3 基因工程菌畢赤酵母高密度高表達發(fā)酵過程GS115宿不同甲醇濃度時甲醇代謝關鍵酶酶活變化

19、過渡階段甲醇代謝途徑關鍵酶酶活性曲線不同甲醇濃度時甲醇代謝關鍵酶酶活變化過渡階段甲醇代謝途徑關鍵畢赤酵母基因工程植酸酶發(fā)酵三階段一、甘油 酵母細胞營養(yǎng)生長階段 (生長的特征是什么： 溶氧降低生物量增加)二、生長與表達的過渡階段甘油耗盡細胞饑餓甲醇誘導（甘油耗盡的特征是什么：甘油漸少甲醇漸增 溶氧降至最低點，甘油耗盡即補甲醇 回升至高點不變）三、外源蛋白表達流加甲醇誘導AOX基因產(chǎn)生醇氧化酶利用甲醇啟動表達外源基因的AOX啟動子(PAOX)表達外源 基因蛋白(外源基因插在能夠利用甲醇的AOX基因中) （甲醇的正面和負面作用：誘導和供碳源；對細胞有毒害作用）畢赤酵母基因工程植酸酶發(fā)酵三階段一、甘油

20、 基因工程植酸酶發(fā)酵OUR:150200 mol/h.m3基因工程植酸酶發(fā)酵OUR:150200 mol/h.m3特點高密度 先得到高的細胞量發(fā)酵分階段 生長和誘導碳源為甘油和甲醇甲醇作碳源也作誘導劑精確的控制 微觀代謝反應在宏觀數(shù)據(jù)上，反過來宏觀數(shù)據(jù)又調(diào)節(jié)代謝方向的進行特點高密度 先得到高的細胞量 第九節(jié) 發(fā)酵終點的判斷 不同類型的發(fā)酵，要求達到的目標不同，因而對發(fā)酵終點的判斷標準也應有所不同。一般對發(fā)酵及原材料成本占整個生產(chǎn)成本主要部分的發(fā)酵品種，主要追求提高生產(chǎn)率(kg/m3h)，（體積生產(chǎn)率）得率(kg產(chǎn)物/kg基質(zhì))發(fā)酵系數(shù)(kg產(chǎn)物罐容積m3發(fā)酵周期h)。 如下游提取精制成本占主要

21、部分，和產(chǎn)品價格比較貴，則除了要求高的產(chǎn)率和發(fā)酵系數(shù)外還要求高的產(chǎn)物濃度。 第九節(jié) 發(fā)酵終點的判斷計算總的生產(chǎn)率，應以放罐時發(fā)酵單位除以總的發(fā)酵生產(chǎn)對間，而總發(fā)酵生產(chǎn)時間不僅包括發(fā)酵周期，也包括從前一批放罐、洗罐和消毒新培養(yǎng)基所需的時間，如下圖所示?？偟纳a(chǎn)率可用從發(fā)酵終點到下批發(fā)酵終點間的直線斜率來代表最高生產(chǎn)率可通過原點與生長或產(chǎn)物濃度曲線相切的直線來代表；切點處的細胞或產(chǎn)物濃度比終點最大值低。計算總的生產(chǎn)率，應以放罐時發(fā)酵單位除以總的發(fā)酵生產(chǎn)對間，而從式933可求出發(fā)酵總的生產(chǎn)周期：(9-33)tT,tD和tL放罐、洗罐、檢修的工作時間，打料、滅菌時間和停滯期所需時間；X0和XF起始和終

22、了的細胞濃曲， 最大比生長速率。從式933可求出發(fā)酵總的生產(chǎn)周期：(9-33)tT,tD和如要提高總的生產(chǎn)率則有必要縮短發(fā)酵周期。這就是要在產(chǎn)物合成速率較低時放罐，延長發(fā)酵雖然略能提高產(chǎn)物濃度，但生產(chǎn)率下降，且消耗每千瓦電力，每噸冷卻水所得產(chǎn)量也下跌，成本提高。放罐時間對下游工序有很大影響。如放罐時間過早，會殘留“過多的養(yǎng)分，如糖、脂肪、可溶性蛋白等,對提取不利，這些物質(zhì)能增加乳化作用或干擾樹脂的交換2如放罐時間太晚，菌絲自溶，不僅會延長過濾時間還會使一些不穩(wěn)定的抗生素單位下跌，擾亂提取工段的作業(yè)計劃。 放罐臨近時，加糖、補料或消沫油都要慎重，因殘留物對提煉有影響。補料可根據(jù)糖耗速度計算到放罐

23、時允許的殘留量來控制，一般放罐前16小時左右便停止加糖或消沫油。 如要提高總的生產(chǎn)率則有必要縮短發(fā)酵周期。00.511.522.53081624324048566472808896104112120時間(t)井岡霉素A/%原始菌和誘變菌發(fā)酵過程產(chǎn)井岡霉素曲線誘變菌K-2-27原始菌KN-1600.511.522.5308162432404856647菌株井岡霉素A產(chǎn)量g/100ml 生產(chǎn)率（g產(chǎn)物/Lh） 得率（g產(chǎn)物/g基質(zhì)） 發(fā)酵系數(shù)（g產(chǎn)物/罐容積L發(fā)酵周期h）KN-161.910.3980.1910.177K-2-273.810.3370.3810.185原始菌和誘變菌生產(chǎn)率、得率、發(fā)

24、酵系數(shù)比較 KN-161.910.3980.1910.177K-判斷放罐的指標主要有 產(chǎn)物濃度過濾速度、 粘度氨基氮、菌絲形態(tài)、pH、培養(yǎng)液的外觀等。 一般菌體自溶前總有些跡象，如氨基氮開始升高，PH上升，菌絲碎片增多，粘度增加，過濾速度降低，最后一項對染菌罐尤為重要。 老品種的抗生素發(fā)酵放罐時間一般都根據(jù)作業(yè)計劃放罐。但在發(fā)酵異常(包括染菌)的情況下，放罐時間就需當機立斷，以免倒罐。新品種發(fā)酵更需摸索合理的放罐時間。不同抗生素品種的發(fā)酵終點的判斷略有出入，絕大多數(shù)掌握在菌絲開始自溶前，極少數(shù)則在菌絲部分自溶后，以便抗生素在菌絲體內(nèi)釋放出來?？傊l(fā)酵終點的判斷須綜合多方面的因素統(tǒng)籌考慮。判斷放罐的指標主要有 討論題 1、工業(yè)微生物的應用開發(fā)方面有哪些工作可做，你認為