動(dòng)物細(xì)胞工程第三節(jié) 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)課件 高中生物競(jìng)賽

1、第三節(jié) 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可免受機(jī)體內(nèi)環(huán)境因素的影響，避免了個(gè)體差異性，便于探索各種物理、化學(xué)和生物因素對(duì)腫瘤細(xì)胞生命活動(dòng)的影響。既便于從細(xì)胞水平上研究腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，又便于從基因及分子水平上研究癌變的發(fā)生機(jī)理。可長(zhǎng)期傳代、保存，便于觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性和遺傳行為的改變?？捎糜诳焖俸Y選抗癌藥物和研究耐藥機(jī)理。研究周期短，比較經(jīng)濟(jì)。應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行腫瘤研究?jī)?yōu)點(diǎn)如下: 1.形態(tài)和性狀 2.生物特性 3.永生性 4.侵潤(rùn)性 5.異質(zhì)性 6.細(xì)胞遺傳性一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)特性腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞界限清晰；核膜、核仁輪廓明顯，核仁多、核漿豐富。折光性強(qiáng)，電鏡觀察細(xì)胞表面微絨毛多而細(xì)密，與腫瘤

2、細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和粘附不依賴性有關(guān)。1.形態(tài)和性狀電鏡下的Hela細(xì)胞在無(wú)血清或低血清(2%5%)時(shí)仍能生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求不高；在軟瓊脂培養(yǎng)時(shí)單個(gè)細(xì)胞能形成集落；生長(zhǎng)方向性消失，失去接觸抑制，癌細(xì)胞數(shù)量增多時(shí)可呈多層重疊生長(zhǎng)；細(xì)胞飽和密度大，分裂指數(shù)高，細(xì)胞倍增周期短。2.生物特性永生性也稱不死性，在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為可無(wú)限制傳代；體外培養(yǎng)的永生性和體內(nèi)腫瘤的惡性(包括侵潤(rùn)性)是兩種性狀，受不同基因調(diào)控；惡性腫瘤多數(shù)在體外培養(yǎng)時(shí)并不容易獲得成功，生長(zhǎng)增殖能力并不旺盛，永生性可在體外培養(yǎng)后獲得。3永生性 侵潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞仍保持有這種特性，當(dāng)與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能侵

3、潤(rùn)入其他正常組織中，甚至能穿透人工隔膜。4侵潤(rùn)性加入50um藥物Baicalein處理遷移-劃痕實(shí)驗(yàn)(wound healing assay)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，實(shí)驗(yàn)成本低，可以用來(lái)檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。侵襲-Transwell assay將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，可以研究上下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響內(nèi)置杯單層細(xì)胞通透膜上室下室5異質(zhì)性 腫

4、瘤細(xì)胞都是由增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成，屬于異質(zhì)性，其中有的衰老、退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，只有那些處于活躍增殖的腫瘤干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分，腫瘤干細(xì)胞易于生長(zhǎng)增殖。6細(xì)胞遺傳性 體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞失去了二倍體核型，呈異倍體或多倍體，常有非整倍染色體出現(xiàn)。區(qū)別正常成纖維細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞的常用指標(biāo)續(xù)表3二、培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性的檢測(cè)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞一旦建立細(xì)胞系就需要進(jìn)行一系列的細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定。目的在于：證明培養(yǎng)的細(xì)胞是否來(lái)自原來(lái)的腫瘤細(xì)胞。 說(shuō)明腫瘤組織類型。 描述腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。通常要檢查下列項(xiàng)目：1.組織起源：應(yīng)說(shuō)明培養(yǎng)材料起源于哪個(gè)胚層

5、、器官組織、什么樣供體、何種疾病等，必要時(shí)要提供病理診斷鑒定資料。2.形態(tài)觀察：觀察細(xì)胞一般形態(tài)如細(xì)胞形狀，核漿比例倒置，有豐富的三極或多極有絲分裂，核仁清晰、多個(gè)，微絲、微管排列紊亂。3.細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)： 檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞分裂指數(shù)，倍增時(shí)間及細(xì)胞周期。癌細(xì)胞失去正常的接觸抑制，呈多層生長(zhǎng)，生長(zhǎng)旺盛，倍增時(shí)間縮短，飽和密度大，分裂指數(shù)較高，具無(wú)限增殖能力，細(xì)胞浸潤(rùn)能力較強(qiáng)等。4.軟瓊脂培養(yǎng)： 癌細(xì)胞在低密度下仍具有高度存活率，并在軟瓊脂中形成集落。5.細(xì)胞核型分析： 檢測(cè)核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量，有無(wú)標(biāo)記染色體，染色體帶型等，癌細(xì)胞大多為異倍體，多倍體，并有標(biāo)記染色體。6. 動(dòng)物致瘤試驗(yàn)：裸鼠

6、背部皮下接種1109 2109/L癌細(xì)胞能生長(zhǎng)形成實(shí)體瘤，其組織學(xué)形態(tài)與原發(fā)瘤相似。7.組織化學(xué)檢查：癌細(xì)胞中脫氧核糖核酸、酸性磷酸酶和磷脂增多，堿性磷酸酶下降，乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性也改變。8.其他生物學(xué)特性檢測(cè)：凝集試驗(yàn)等。動(dòng)物致瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用RPM1640，DMEM、Mc-Coy-5A等培養(yǎng)基，10%血清即可，在原代培養(yǎng)時(shí)最好能加入生長(zhǎng)因子或原患者血清(1%2%)以利細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)方法，主要有組織塊法、酶消化法、脫落細(xì)胞法等。(二)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法細(xì)胞系(株)污染情況鑒定(1)病毒鑒定：如EB病毒的核心抗原(EBNA)可在許多B淋巴細(xì)胞系、宮頸癌、鼻咽癌及白血細(xì)胞系中檢出。(2)支原體檢查： (3)細(xì)胞系(株)交叉污染的鑒測(cè)：細(xì)胞系(株)交叉污染的鑒測(cè)：遺傳學(xué)上用檢測(cè)人Y染色體、染色體Q帶、G帶核型分析。免疫學(xué)上鑒定人類細(xì)胞HLA或免疫細(xì)胞分析。生物化學(xué)上鑒定同功酶的種特性及多態(tài)酶的表型差異性。 來(lái)源于患者腫瘤組織的異種