核酸分子雜交技術(shù)掃盲版教學(xué)用

1、核酸分子雜交技術(shù)掃盲版-教學(xué)用一、什么是核酸分子雜交？不同來源的單鏈核酸分子在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對的原則形成雙鏈雜交體的過程2、堿基不完全互補(bǔ)配對也能雜交1、可以是DNA, 也可以是RNA，但必須是單鏈3、不同的分子形成的雜交體穩(wěn)定性不同注意核酸分子雜交技術(shù)利用核酸分子雜交檢測靶序列的一類技術(shù)目的：檢測靶序列二、核酸分子雜交的原理堿基互補(bǔ)：DNA與DNA雜交： A=T、 GC ; DNA與RNA雜交: A=U、 GC ; 基本原理： 堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性變性： 升高溫度至94左右，使核酸雙鏈解開為兩條單鏈升高溫度變性只是一種方式復(fù)性： 緩慢降低溫度（ 52左右），變性的兩條單鏈重新形成互

2、補(bǔ)雙鏈。 hybridization DNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C探針探針探針探針必須有標(biāo)記標(biāo)記的目的是為了檢測探針必須有標(biāo)記探針必須有標(biāo)記三、核酸分子雜交的分類按參與反應(yīng)分子DNA和RNA的雜交DNA和DNA的雜交放射性標(biāo)記RNA和RNA的雜交非放射性標(biāo)記按支持介質(zhì)原位雜交液相雜交按標(biāo)記固相雜交菌落雜交斑點(diǎn)雜交和狹縫雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交基因芯片固

3、相雜交菌落雜交斑點(diǎn)雜交和狹縫雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交陽性克隆鑒定無需電泳和轉(zhuǎn)膜方便快捷檢測DNA檢測RNA2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理Northern印跡與Southern 印跡的不同點(diǎn)1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性3、靶序列： Northern印跡靶核酸為RNA； Southern 印跡靶核酸為DNA四、探針及其標(biāo)記探針:1. 能與靶序列雜交；2. 能被特異性檢測。雜交必須有探針標(biāo)記的目的是為了檢測探針必須有標(biāo)記四、探針及其標(biāo)

4、記寡核苷酸探針RNA探針DNA探針探針的種類優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定；易得；易標(biāo)記；雜交適宜的溫度范圍寬優(yōu)點(diǎn)：DNA探針的缺點(diǎn)；此外，雜交后可用RNA酶水解未雜交的RNA探針缺點(diǎn)：雜交前需變性；雜交效率較低（競爭）；雜交體不如RNA穩(wěn)定缺點(diǎn)：標(biāo)記復(fù)雜；不穩(wěn)定（探針本身）；雜交適宜的溫度范圍窄優(yōu)點(diǎn)：短，穿透性好；可區(qū)分單堿基突變?nèi)秉c(diǎn)：攜帶的標(biāo)記分子少，檢測時敏感性較低；應(yīng)用范圍較窄探針的標(biāo)記切口平移法DNaseDNA聚合酶（53核酸外切酶活性）DNA聚合酶（53核酸外切酶活性53 聚合酶活性）3dNTP1dNTP#DNaseDNA聚合酶（53核酸外切酶活性53 聚合酶活性）模板DNA切開模板DNA形成一到幾個

5、堿基的缺口摻入標(biāo)記基團(tuán)缺口平移探針的標(biāo)記隨機(jī)引物法DNA模板引物和模板DNA結(jié)合加入klenow片斷、3種dNTP和1種標(biāo)記dNTP引物延伸五、怎樣做核酸分子雜交？雜交信號檢測1、預(yù)雜交2、雜交3、洗脫核酸分子與固相介質(zhì)的結(jié)合1、探針的制備2、核酸變性、轉(zhuǎn)移、固定擴(kuò)增、標(biāo)記純化檢測為獲得更好的雜交效果控制條件，特異結(jié)合洗去多余探針檢測標(biāo)記物核酸分子雜交操作中的主要思想一、探針要和靶序列雜交（特異性）信號二、探針不應(yīng)和除靶序列的其他地方結(jié)合核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標(biāo)記核酸探針檢測雜交信號標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含DN