基于感官評價和GC-MS分析嗜鹽芳香酵母 對速成永川豆豉香氣的影響

1、PAGE 10 -基于感官評價和GC-MS分析嗜鹽芳香酵母對速成永川豆豉香氣的影響豆豉是我國歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，根據(jù)制曲過程中微生物的不同分為曲霉型、毛霉型、細(xì)菌型和根霉型4種豆豉1。傳統(tǒng)永川豆豉是毛霉型豆豉的代表，其豉香濃郁、烏黑油亮、質(zhì)地入口化渣，一直深受消費(fèi)者的喜愛。但是傳統(tǒng)永川豆豉是通過接種空氣中的微生物自然發(fā)酵，受環(huán)境、季節(jié)等多種因素的影響大，發(fā)酵周期長達(dá)1年2，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。利用曲霉制曲和低鹽高溫發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的速成永川豆豉能將后發(fā)酵時間縮短為30d左右，大大提高了生產(chǎn)效率。但速成永川豆豉工藝縮短發(fā)酵周期的同時也會導(dǎo)致豆豉的香氣不足。楊洋等3通過FlashProfile法發(fā)

2、現(xiàn)傳統(tǒng)永川豆豉和速成永川豆豉的感官性質(zhì)存在顯著差異。眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)永川豆豉的揮發(fā)性物質(zhì)的種類與含量均高于速成永川豆豉4-6。因此，提高速成永川豆豉風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量對解決其香氣不足的問題具有重要意義。與速成永川豆豉相比，傳統(tǒng)永川豆豉在制曲和后發(fā)酵過程中具有更豐富的微生物物種組成7，其中酵母8-9對傳統(tǒng)永川豆豉的風(fēng)味具有重要作用。例如漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)有利于酯類和醇類化合物的產(chǎn)生10，是東北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中的優(yōu)勢酵母11。魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)有利于酯類、醇類及吡嗪類化合物的產(chǎn)生，具有甜香、麥芽香等香氣特征，可

3、用于提高醬油的香氣品質(zhì)12。此外，多種酵母混合發(fā)酵更有利于特征風(fēng)味物質(zhì)的增加，Z.rouxii與季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)混合發(fā)酵能夠產(chǎn)生更多的醇類、呋喃酮類、酯類等特征風(fēng)味物質(zhì)13。因此，后發(fā)酵過程中缺失酵母是速成永川豆豉香氣不足的重要原因，但目前關(guān)于酵母對豆豉香氣影響的研究還很少。本研究基于前期對不同菌株單一發(fā)酵、混合發(fā)酵速成永川豆豉的增香效果，用魯氏接合酵母和漢遜德巴利酵母對速成永川豆豉等比例混合發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過感官定量描述分析(quantitativedescriptionanalysis，QDA)和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(solidp

4、hasemicroextraction-gaschromatography-massspectrometry，SPME-GC-MS)技術(shù)探究嗜鹽芳香酵母在不同發(fā)酵條件下對速成永川豆豉香氣特征和風(fēng)味物質(zhì)的影響。1材料與方法1.1材料與試劑速成永川豆豉，重慶永川豆豉有限公司。試劑：麥芽汁培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；NaCl，重慶躍翔化工有限公司；1,3-二氯苯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%)，Dr.EhrenstorferGmbH，德國。菌株：魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)ZR21和漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansen

5、ii)DH06均由本實(shí)驗(yàn)室從重慶永川豆豉有限公司傳統(tǒng)永川豆豉中分離鑒定保藏。1.2儀器與設(shè)備US1709M012氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀、HP-5色譜柱，Agilent公司；57330-U手動固相微萃取進(jìn)樣器、頂空固相微萃取纖維頭(50/30DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；JJ-2BS組織搗碎機(jī)，常州崢嶸儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；AJ31002精密電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1速成永川豆豉的二次發(fā)酵將Z.rouxiiZR21接種在含80g/LNaCl的麥芽汁培養(yǎng)基中，D.hanseniiDH06接種在含80

6、g/LNaCl的YPD培養(yǎng)基中，28培養(yǎng)3d。在高、中、低溫度(35、20和10)下菌種等比例混合，以高、低2種濃度接種(105和106CFU/kg)，二次發(fā)酵速成永川豆豉30、45d，具體工藝見表1。表1永川豆豉樣品信息Table1InformationofYongchuanDouchisamples1.3.2感官分析1.3.2.1樣品準(zhǔn)備稱取10g豆豉樣品盛放在30mL一次性帶蓋透明塑料杯中，3位隨機(jī)數(shù)字編碼。1.3.2.2感官評價過程參考文獻(xiàn)14-15的方法，7名經(jīng)過培訓(xùn)的感官評價人員通過18種市售豆豉和12種嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉建立豆豉香氣描述詞。首先感官評價人員獨(dú)立產(chǎn)生豆豉香氣描述詞

7、。然后感官評價小組合并意思相近詞語，刪除含義模糊、帶有感情色彩詞語，形成一致的豆豉香氣描述詞及其定義。按照GB/T296042022感官分析建立感官特性參比樣的一般導(dǎo)則的方法，選擇適合中國消費(fèi)者的產(chǎn)品作為參比樣，并對參比樣的強(qiáng)度達(dá)成共識。感官評價小組根據(jù)建立的豆豉香氣描述詞對12種嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉和速成永川豆豉的香氣進(jìn)行定量描述分析。每次試驗(yàn)評價34個豆豉樣品，時長約為1.5h。評價1個樣品后，評價人員通過嗅聞溫?zé)岬臐衩砭徑庑嵊X疲勞，休息5min后評價下一個樣品。采用015分值打分制，0表示無，15表示非常強(qiáng)16-17。1.3.3揮發(fā)性成分的測定5-61.3.3.1頂空固相微萃取(sol

8、id-phasemicroextraction，SPME)稱取3g豆豉樣品，粉碎后放入15mL固相微萃取樣品瓶中，加入30L標(biāo)準(zhǔn)品1,3-二氯苯(10.0g/mL)，加蓋密封。在60水浴鍋中平衡20min，插入CAR/DVB/PDMS萃取纖維，萃取30min，將萃取纖維在GC進(jìn)樣口250下解吸5min，進(jìn)行GC-MS分析。1.3.3.2揮發(fā)性成分測定色譜條件：Hp-5非極性毛細(xì)管柱；柱初溫40，以2/min的速率升到80，保持2min，以2.5/min的速率升溫到140，保持1min，以8/min的速率升溫到250；進(jìn)樣口溫度250，溶劑延遲5min，不分流；載氣為氦氣；流量為1.0mL/mi

9、n。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70eV；電壓350V；接口溫度230；掃描范圍m/z25400。1.3.3.3定性定量方法定性分析：采用NISTlibrary譜庫檢索比對進(jìn)行定性。定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)物為1，3-二氯苯。含量按公式(1)計算：(1)式中：ci,未知化合物含量，ng/g；Si,未知化合物峰面積；S,內(nèi)標(biāo)物峰面積；c,內(nèi)標(biāo)物濃度，g/mL；V,內(nèi)標(biāo)物體積，L；m,樣品質(zhì)量，g。1.3.3.4香氣活性值(odoractivityvalue，OAV)OAV按公式(2)計算：(2)式中：ci，揮發(fā)性成分的含量，ng/g；OTi，揮發(fā)性成分在參考文獻(xiàn)中的香氣閾值

10、，mg/kg。1.4數(shù)據(jù)分析利用MicrosoftOfficeExcel2022對樣本所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理計算，采用IBMSPSSStatistic25分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(analysisofvariance，ANOVA)；XLSTAT2022進(jìn)行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)。2結(jié)果與分析2.1感官評價結(jié)果2.1.1豆豉香氣特征詞的建立經(jīng)過15次時長1.5h的評價單元，感官評價小組對豆豉香氣特征詞進(jìn)行開發(fā)、合并、刪減，最終建立了10個香氣特征詞，見表2。表2豆豉香氣特征詞的定義和參比樣Table2Definitionsandreferences

11、ofaromacharacteristicstermsforDouchi2.1.2永川豆豉香氣特征方差分析對QDA結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析發(fā)現(xiàn)(表3)，與速成永川豆豉相比，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的豉香、酸香強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P0.05)，醬香、豆味、霉味強(qiáng)度顯著降低(P0.05)，而在高溫、低濃度菌種的條件下發(fā)酵30d更有利于其香氣特征的變化。表3永川豆豉定量描述分析結(jié)果Table3ResultsofquantitativedescriptiveanalysisofYongchuanDouchi注：同一行不同字母表示在P0.05水平上具有顯著差異2.1.3永川豆豉香氣特征PCA對QDA法

12、的結(jié)果進(jìn)行PCA，如圖1所示，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉均與速成永川豆豉發(fā)生偏離。與高溫發(fā)酵豆豉相比，嗜鹽芳香酵母在中溫和低溫條件下發(fā)酵的豆豉香氣特征更相似，可能是由于高溫條件下細(xì)菌活性增強(qiáng)，酵母發(fā)酵受到一定抑制；但低溫發(fā)酵需要更高的菌種濃度，可能是由于低溫條件下酵母活性較低。與發(fā)酵30d相比，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵45d更有利于香氣特征變化。圖1永川豆豉PCA圖Fig.1PrincipalcomponentanalysisofYongchuanDouchi2.2永川豆豉揮發(fā)性成分分析17揮發(fā)性成分是評價豆豉香氣的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過SPME-GC-MS共檢測出64種揮發(fā)性成分(見附錄)，包括9種酸類、9

13、種醛類、12種酯類、5種酮類、3種醇類、4種酚類、9種吡嗪類、2種呋喃類、9種烴類和2種其他物質(zhì)。由此看出，豆豉揮發(fā)性成分主要由酸類、醛類、酯類、吡嗪類和烴類物質(zhì)構(gòu)成。與速成永川豆豉相比，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的酸類、醛類、酯類、酮類、醇類、吡嗪類、呋喃類及其他揮發(fā)性成分含量整體呈增加趨勢，大多烴類物質(zhì)含量呈減少趨勢。2.3永川豆豉香氣活性物質(zhì)分析一般認(rèn)定，當(dāng)揮發(fā)性化合物的OAV1時對食品香氣具有一定貢獻(xiàn)作用，且OAV越大，其貢獻(xiàn)作用越大。速成永川豆豉共有6種OAV1的揮發(fā)性成分，而嗜鹽芳香酵母發(fā)酵的豆豉則有712種。由表4可知，嗜鹽芳香酵母提高了速成永川豆豉中異戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基

14、吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、3-甲基戊酸、異戊醛、苯乙醛、2-十一酮、愈創(chuàng)木酚、2-戊基呋喃的含量，并新增了7種OAV1的揮發(fā)性成分，包括2-甲基丁醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異己酸乙酯、辛酸乙酯、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪和二甲基三硫。異戊酸和3-甲基戊酸被認(rèn)為是豆類發(fā)酵品中香氣的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)，提供酸味和哈喇味22。2-甲基丁醛、異戊醛和苯乙醛提供麥芽香和蜂蜜味23，可能為豆豉香氣提供積極影響。乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異己酸乙酯、辛酸乙酯等酯類物質(zhì)被描述為果香或者花香味24，酯類物質(zhì)與酵母發(fā)酵作用有密切聯(lián)系，酵母降解脂質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)。同時乙酸乙酯也是傳統(tǒng)永川豆豉特有的主要風(fēng)味

15、物質(zhì)6。2-十一酮提供水果香25，可能為豆豉提供甜香。愈創(chuàng)木酚是煙熏味、熏烤味香氣化合物的典型代表14，為醬油提供煙熏味12，因此，愈創(chuàng)木酚可能與豆豉中煙味有關(guān)。2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪等吡嗪類物質(zhì)提供堅果香26；2-戊基呋喃具有綠豆、黃油味27，在與其他香氣活性物質(zhì)的共同作用下對豆豉香氣產(chǎn)生積極影響。二甲基三硫具有硫味或洋蔥味，多次在醬油、豆瓣醬等發(fā)酵食品中檢測到22，表明該物質(zhì)為發(fā)酵豆制品中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。因此，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵的豆豉能有效增加速成永川豆豉中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。表4永川豆豉中揮發(fā)性成分的閾值和OAVTable4ThresholdandOAVofvolatilecomponentsinYongchuanDouchi注：“-”表示未檢測出3結(jié)論通過對不同條件下嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的感官定量描述分析可知，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的豉香、酸香強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P0.05)，醬香、豆味、霉味強(qiáng)度顯著降低(P0.05)，且最佳發(fā)酵條件為35，接種量105CFU/kg，發(fā)酵時間30d。通過對不同條件下嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的揮發(fā)性成分分析可知，嗜鹽芳香酵母提高了速成永川豆豉中異戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-