2010CB912400-基于冷凍電子顯微鏡學(xué)的生物大分子的高時(shí)空分辨率的結(jié)構(gòu)和功能研究-修正版

1、修正版項(xiàng)目名稱(chēng)：基于冷凍電子顯微鏡學(xué)的生物大分子的高時(shí)空分辨率的結(jié)構(gòu)和功能研究首席科學(xué)家： 高海嘯清華大學(xué)起止年限：2010年1月-2014年8月依托部門(mén)：教育部一、研究?jī)?nèi)容本項(xiàng)目將進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究：課題一，高通量、全自動(dòng)化的冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集和三維重構(gòu)圖像處理方法的研 究a.開(kāi)發(fā)高通量、全自動(dòng)化的電鏡數(shù)據(jù)采集和處理方法，以及高性能的三維重構(gòu)算法在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析工作中，目前有相當(dāng)大的一部分時(shí)間和人工都消耗在重 復(fù)性工作中，例如電鏡膠片的拍攝和掃描，電鏡圖像的預(yù)篩選，三維重構(gòu)計(jì)算中 的某些步驟等。近年來(lái)，隨著冷凍電子顯微學(xué)的蓬勃發(fā)展， 可以達(dá)到的分辨率越 來(lái)越高，相應(yīng)地對(duì)電鏡數(shù)據(jù)量的需求也

2、越來(lái)越大。以核糖體結(jié)構(gòu)解析為例，獲得10?分辨率的核糖體結(jié)構(gòu)需要10萬(wàn)個(gè)冷凍電鏡單顆粒。而在理論上，獲得原子 分辨率（好于3?）則至少需要100萬(wàn)個(gè)單顆粒電鏡圖像。如果以目前普遍使用 的手動(dòng)方式來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理， 那么僅僅電鏡膠片的拍攝、掃描，以及電鏡 圖像的預(yù)篩選等工作就需要數(shù)月之久！這實(shí)際上已經(jīng)成為阻礙當(dāng)前高分辨率的冷 凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的主要瓶頸之一。解決這一問(wèn)題的有效途徑就是開(kāi)發(fā)高通量、全 自動(dòng)化的電鏡數(shù)據(jù)采集和處理方法以及高性能的三維重構(gòu)算法，以最大程度地提高對(duì)超大電鏡數(shù)據(jù)量的采集和處理的效率，減少在這些方面耗費(fèi)的人工和時(shí)間。自動(dòng)化的電鏡數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)對(duì)電鏡的穩(wěn)定性和計(jì)算機(jī)控制下的可操

3、作性要 求很高。特別是開(kāi)發(fā)基于單顆粒重構(gòu)方法的自動(dòng)化采集系統(tǒng)，要求能夠自動(dòng)識(shí)別大量的適合成像的樣品區(qū)域并長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)監(jiān)控。由于開(kāi)發(fā)難度很高，目前國(guó)際上在這一前沿領(lǐng)域的工作才剛剛開(kāi)始，而真正能夠?qū)崿F(xiàn)全自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集的系統(tǒng)更 是屈指可數(shù)。由本項(xiàng)目研究人員雷建林教授在過(guò)去數(shù)年中主持開(kāi)發(fā)的 AutoEMation是其中的佼佼者。與傳統(tǒng)的手工采集方法相比，AutoEMation的巨大優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)蝹€(gè)樣品進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)數(shù)日甚至數(shù)周的持續(xù)數(shù)據(jù)采集。以多輸出通道的4kx4k CCD相機(jī)為例，24小時(shí)內(nèi)可至少收集2000張電鏡照片，比手工采集效 率高十倍以上。止匕外，AutoEMation還能自動(dòng)地在低電子輻照劑量下根

4、據(jù)樣品情 況選擇在同一個(gè)孔洞中的不同區(qū)域多次拍攝，從而大大提高了樣品的利用率。而這在手工電鏡數(shù)據(jù)采集中是無(wú)法做到的。AutoEMation目前已經(jīng)在哥倫比亞大學(xué)、德州大學(xué)休斯頓醫(yī)學(xué)中心、哈佛大學(xué)等多家冷凍電鏡研究機(jī)構(gòu)全面運(yùn)轉(zhuǎn)或試運(yùn)轉(zhuǎn)，并已多次穩(wěn)定地對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集一周以上，迄今共收集十余萬(wàn)張CCD照片。在本課題中，我們將在A(yíng)utoEMation現(xiàn)有的核心構(gòu)架的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)一套完 備的高通量和全自動(dòng)化的電鏡數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)。首先，針對(duì)目前 AutoEMation還只能運(yùn)行在美國(guó)FEI公司的Tecnai系列冷凍電鏡上的限制，將其 擴(kuò)展到我們剛剛在清華大學(xué)和中科院生物物理所購(gòu)置的Titan

5、Krios冷凍電鏡平臺(tái)上。需要指出的是，目前還沒(méi)有任何針對(duì)Titan Krios冷凍電鏡的自動(dòng)化數(shù)據(jù)采 集系統(tǒng)。我們?cè)谶@方面的工作將是國(guó)際上最前沿的。其次，將AutoEMation擴(kuò)展至具有支持單顆粒采集，傾轉(zhuǎn)系列數(shù)據(jù)采集(包括電子斷層分析和單顆粒傾轉(zhuǎn)) 等多項(xiàng)重要冷凍電鏡操作功能。最后，在自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)電鏡 數(shù)據(jù)的預(yù)處理、預(yù)篩選，并由此探索和優(yōu)化電鏡樣品的理想處理和數(shù)據(jù)收集條件， 如包埋冰層的最佳厚度、電子束的最佳輻照強(qiáng)度和最佳欠焦范圍等。冷凍電鏡圖像的三維重構(gòu)有很高的計(jì)算需求，特別是其中alignment和re巾nement的計(jì)算部。在10年前，這些計(jì)算任務(wù)主要是在具有共享

6、內(nèi)存架構(gòu)和多 處理器的專(zhuān)用計(jì)算機(jī)上完成。隨著對(duì)分辨率的要求越來(lái)越高，所需要處理的電鏡 圖像的數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，過(guò)去那種依賴(lài)于昂貴的專(zhuān)用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)處 理方式已不再可行，而需要采用以 LINUX為操作系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)集群。在本課題 中，我們將會(huì)針對(duì)高性能并行化這一需求對(duì)相關(guān)三維重構(gòu)算法進(jìn)行優(yōu)化。以目前在國(guó)際冷凍電鏡領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的三維重構(gòu)系統(tǒng)SPIDER (System for ProcessingImage Data from Electron microscopy and Related fields ) 為核心，開(kāi)發(fā)自動(dòng)化的 電鏡數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。并將利用數(shù)據(jù)庫(kù)集中管理從樣品制備、電鏡數(shù)據(jù)

7、采集、數(shù)據(jù)分析、一直到三維重構(gòu)的全套過(guò)程，以實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)完整的電鏡結(jié)構(gòu)解析項(xiàng)目的高 效管理和處理。b.開(kāi)發(fā)和優(yōu)化結(jié)構(gòu)不均一性存在條件下的高性能分類(lèi)方法，并應(yīng)用于研究生物大分子復(fù)合體的動(dòng)態(tài)過(guò)程和功能結(jié)構(gòu)不均一性是指由于生物大分子復(fù)合體自身結(jié)構(gòu)的內(nèi)在靈活性， 在采集到 的同一組冷凍電鏡數(shù)據(jù)中經(jīng)常包含著它們不同的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。 目前，結(jié)構(gòu)不均一性 影響冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的分辨率已是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題。 這主要是由于生物大分子 復(fù)合體往往有多個(gè)與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)共存，通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段很難將它們分離。因而 在采集到的冷凍電鏡照片中，不同的單顆?？赡艽聿煌墓δ軕B(tài)結(jié)構(gòu)， 它們之 間結(jié)構(gòu)的差異將直接降低三維重構(gòu)密度圖的分辨

8、率。在嚴(yán)重情況下，甚至?xí)?dǎo)致 局部密度圖殘缺。當(dāng)前，冷凍電子顯微學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究熱點(diǎn)就是針對(duì)結(jié)構(gòu)不均一性的成熟的、普適的分類(lèi)方法的研發(fā)。利用冷凍電鏡數(shù)據(jù)中豐富的內(nèi)在結(jié)構(gòu)信息，將存在結(jié)構(gòu)不均一性的冷凍電鏡數(shù)據(jù)在三維重構(gòu)前進(jìn)行分類(lèi)。目前采用的分類(lèi)方法主要分為兩類(lèi)，即監(jiān)督性方法和非監(jiān)督性方法。前者的特點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便，但是必 須引入合適的參考結(jié)構(gòu)(reference volume)。分類(lèi)結(jié)果的優(yōu)劣往往取決于參考結(jié) 構(gòu)選取的好壞。在冷凍電子顯微學(xué)領(lǐng)域，現(xiàn)有的分類(lèi)方法的研究工作大都屬于這 一類(lèi)，主要是基于交叉關(guān)聯(lián)函數(shù)的監(jiān)督性分類(lèi)方法。由于監(jiān)督性分類(lèi)方法對(duì)預(yù)先引入的參照結(jié)構(gòu)要求較高，在使用不當(dāng)?shù)那闆r下常

9、常會(huì)導(dǎo)致分類(lèi)后的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)偏 差甚至錯(cuò)誤，因此開(kāi)發(fā)有效的非監(jiān)督性分類(lèi)方法來(lái)解決冷凍電鏡中的生物大分子 結(jié)構(gòu)不均一性尤為重要。然而，由于冷凍電鏡數(shù)據(jù)的信噪比極低， 加之采集到的 電鏡照片中的單顆粒的投影方向有待確定，使得分類(lèi)問(wèn)題變得非常復(fù)雜。目前， 針對(duì)非監(jiān)督性分類(lèi)方法的研究工作大多還只是在嘗試階段。其中，由本課題負(fù)責(zé)人高海嘯教授參與開(kāi)發(fā)的基于最大似然法的分類(lèi)方法，是目前唯一一個(gè)在實(shí)踐中得到運(yùn)用的非監(jiān)督性分類(lèi)方法。在本課題中，我們將在過(guò)去的分類(lèi)方法的研究工 作基礎(chǔ)上，針對(duì)性地選擇具體的生物大分子復(fù)合體作為研究體系，通過(guò)提高和完善現(xiàn)有的監(jiān)督性和非監(jiān)督性方法的獨(dú)立性和普適性，包括改善已有監(jiān)督性方法對(duì)

10、參照對(duì)象的過(guò)度依賴(lài)，建立有效的分類(lèi)檢驗(yàn)算法等，進(jìn)一步嘗試開(kāi)發(fā)全新高效的 冷凍電鏡數(shù)據(jù)分類(lèi)方法。課題二，低對(duì)稱(chēng)或非對(duì)稱(chēng)性的生物大分子復(fù)合體的高分辨結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)過(guò)程的 研究細(xì)胞中所有的重大生命過(guò)程都離不開(kāi)生物大分子的參與 。生物大分子發(fā)揮功 能需要其它生物分子的協(xié)同作用，形成穩(wěn)定的或者不穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)的復(fù)合體。這些 大分子復(fù)合體通常都處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程，為它們的高分辨結(jié)構(gòu)的解析帶來(lái) 了很大困難。本課題將在課題一的基礎(chǔ)之上，利用單顆粒重構(gòu)技術(shù)解析幾類(lèi)與重大生命過(guò)程相關(guān)的生物大分子復(fù)合體的高分辨結(jié)構(gòu)，包括一些細(xì)胞內(nèi)可溶的大分 子復(fù)合體（如核糖體）、膜蛋白或者與膜相關(guān)聯(lián)的蛋白、以及與人類(lèi)疾病和健康 密切

11、相關(guān)的細(xì)胞膜上受體與配基復(fù)合物（如細(xì)胞因子 /受體復(fù)合物）。a.細(xì)胞內(nèi)可溶性生物大分子復(fù)合體（核糖體等）的結(jié)構(gòu)和功能的研究冷凍電子顯微學(xué)在分子機(jī)器的研究中已經(jīng)應(yīng)用得非常廣泛。以 DNA到蛋白 質(zhì)的過(guò)程為例，從DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪切、以至蛋白質(zhì)的合成這一 系列連續(xù)的遺傳信息傳遞過(guò)程中，冷凍電子顯微學(xué)都有著重要的貢獻(xiàn)。例如，真 核細(xì)胞的 DNA Polymerase epsilon complex 和 MCM helicase, transcriptional complex, spliceosome都已經(jīng)有中等分辨率（1-3nm）的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。我們將 會(huì)以核糖體的高分辨功能態(tài)結(jié)構(gòu)為

12、重點(diǎn)，同時(shí)展開(kāi)對(duì)細(xì)胞中其它的一些重要分子 機(jī)器的結(jié)構(gòu)解析，如蛋白酶體和各種分子伴侶復(fù)合體等。自2000年核糖體的大小亞基分別被解析以來(lái)，在過(guò)去的十年中，核糖體的 晶體學(xué)研究取得了巨大的進(jìn)展。迄今已經(jīng)有E.coli和T. thermophilus的兩個(gè)原子 分辨率的70S核糖體被解析。盡管這些晶體結(jié)構(gòu)提供了豐富的核糖體結(jié)構(gòu)信息， 目前對(duì)詳細(xì)的蛋白合成分子機(jī)理卻仍未完全清楚。這主要是由于蛋白質(zhì)翻譯是一 個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，每一步都有許多蛋白翻譯因子參與并與核糖體相互作用。迄 今為止，只有RF1、RF2和RRF這三個(gè)因子和核糖體所形成的復(fù)合體的晶體結(jié) 構(gòu)被解析。與之形成對(duì)照的是，冷凍電子顯微學(xué)已經(jīng)成功

13、解析出原核細(xì)胞的核糖 體和所有翻譯因子形成的各種復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，其中分辨率最高的已達(dá)到 6.7?。這些冷凍電鏡結(jié)構(gòu)不僅大大地豐富了我們對(duì)蛋白合成的動(dòng)態(tài)過(guò)程的理解， 而且通過(guò)將核糖體高分辨的晶體結(jié)構(gòu)嵌入”到這些不同功能態(tài)下的電鏡三維重構(gòu)圖中，還可以構(gòu)建出一系列準(zhǔn)原子分辨率的功能態(tài)結(jié)構(gòu)模型。我們擬從以下幾個(gè)方面開(kāi)展針對(duì)核糖體的結(jié)構(gòu)和功能的研究：（1）建立一個(gè)高效的、受控的核糖體體外轉(zhuǎn)錄體系。分離純化核糖體的大小亞基以及所有翻譯 因子，在體外模擬體內(nèi)的翻譯過(guò)程，精確控制核糖體復(fù)合體停留在指定的功能 態(tài)，為下一步的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析提供優(yōu)質(zhì)樣品。并在這一系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，采用 生物化學(xué)的方法研究蛋白翻譯過(guò)

14、程中幾個(gè)懸而未決的問(wèn)題，比如在延伸過(guò)程中， EF-G是如何促進(jìn)核糖體上的構(gòu)象變化；GTP水解的作用到底是什么等。（2）核糖體的多種功能態(tài)的高分辨結(jié)構(gòu)解析。在課題一的研究基礎(chǔ)上，采用高通量的冷 凍電鏡方法，解析高分辨率的核糖體的多種功能態(tài)結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)手 段，構(gòu)建準(zhǔn)原子分辨率的各種功能態(tài)模型，從而揭示蛋白質(zhì)翻譯步驟中的分子機(jī) 理。（3）核糖體的生物起源過(guò)程的相關(guān)功能和結(jié)構(gòu)研究，如原核生物核糖體的組 裝過(guò)程中的一系列的酶催化反應(yīng)。在這些反應(yīng)中，大小亞基前體中的rRNA被修剪和修飾。我們將在體外構(gòu)建包含這些酶因子 （如RimM, RbfA, Era, Obg, Der以 及YlqF等）的核

15、糖體復(fù)合體，解析它們的三維結(jié)構(gòu)，從而了解這些酶和核糖體 亞基之間的相互作用，并根據(jù)獲得的三維信息，進(jìn)一步設(shè)計(jì)生物實(shí)驗(yàn)，以深入開(kāi) 展相關(guān)的功能性研究。b.膜蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能的研究人類(lèi)的很多重大疾病包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等都和 膜蛋白密切相關(guān)。對(duì)膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究是我們進(jìn)一步了解這些疾病 的分子成因以及設(shè)計(jì)針對(duì)性藥物的基礎(chǔ)。迄今為止，只有大約 300多個(gè)膜蛋白的 結(jié)構(gòu)被解析，還遠(yuǎn)不到已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄中所有結(jié)構(gòu)的1%。膜蛋白及其復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)的解析，以及其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究是目前蛋白質(zhì)科學(xué)研究的 難題和熱點(diǎn)。X-射線(xiàn)晶體學(xué)仍然是獲得高分辨率的膜蛋白三維結(jié)構(gòu)

16、的主要手 段。然而，多數(shù)膜蛋白是以復(fù)合體的形式發(fā)揮功能，由嵌入膜內(nèi)的疏水部分（或者亞基）和伸在膜外的親水部分（或亞基）組成兼性蛋白復(fù)合體，如數(shù) 量眾多的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體、膜蛋白受體、核膜上的核孔復(fù)合體等。這些膜蛋 白復(fù)合體一般是由幾個(gè)或者幾十個(gè)蛋白組成， 而且在執(zhí)行功能的時(shí)候寡聚結(jié)構(gòu)狀 態(tài)可能發(fā)生改變。盡管膜蛋白復(fù)合體的局部結(jié)構(gòu)可以通過(guò)X-射線(xiàn)晶體學(xué)的方法得到，但是其整體組裝和動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)變化， 卻需要借助獨(dú)具手段的單顆粒冷凍電 子顯微學(xué)來(lái)進(jìn)行研究。國(guó)際上綜合運(yùn)用X-射線(xiàn)晶體學(xué)與單顆粒冷凍電鏡技術(shù)研究膜蛋白復(fù)合體的工作也剛剛開(kāi)始開(kāi)展，例如對(duì)細(xì)胞因子IL-6與膜上受體復(fù)合物的研究。我們擬從以下三

17、個(gè)方面開(kāi)展工作：（1）針對(duì)樣品制備、電鏡圖像處理以及圖 像篩選等方面，開(kāi)展膜蛋白復(fù)合體的單顆粒三維重構(gòu)的方法學(xué)研究。 （2）細(xì)胞膜 上受體與配基復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能的研究。 我們將結(jié)合單顆粒冷凍電子顯微學(xué)及X-射線(xiàn)晶體學(xué)技術(shù)，以白細(xì)胞介素-1 （Interleukin-1, IL-1 ）家族細(xì)胞因子與受體 復(fù)合物為目標(biāo)，開(kāi)展結(jié)構(gòu)解析以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究工作。目前為止，已發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素-1家族分子有11個(gè)，其中研究最為深入的包括IL-1 , IL-1 , IL-1 receptor antagonist （IL-1ra）, IL-18和IL-33,這些細(xì)胞因子具有廣泛的生物 活性，在機(jī)體免疫

18、應(yīng)答、炎癥、自身免疫和組織損傷過(guò)程中起著重要作用。它們 還與許多疾病的病理過(guò)程相關(guān)，如敗血性休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸部疾病、 發(fā)熱等）。IL-1家族細(xì)胞因子的作用是通過(guò)細(xì)胞膜上的受體分子介導(dǎo)，進(jìn)而誘發(fā) 胞內(nèi)的多條信號(hào)傳導(dǎo)通路。目前已知的 IL-1受體分子包括IL-1RI , IL-1RII , IL-1RAcP, IL-18R , IL-18R , T1/ST2等。IL-1家族細(xì)胞因子與受體組成三元 復(fù)合物，例如IL-1與IL-1的作用通過(guò)受體IL-1RI與IL-1RAcP介導(dǎo)，IL-18的 受體分子包括IL-1 R 與IL-18R , IL-33的受體分子包括T1/ST2和IL-1RAc

19、P。 對(duì)這些IL-1家族細(xì)胞因子與受體三元復(fù)合物的單顆粒冷凍電鏡及X-射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)研究不僅能給我們提供一個(gè)IL-1信號(hào)從胞外傳導(dǎo)至胞內(nèi)的完整畫(huà)面，也為以IL-1信號(hào)通路為靶標(biāo)的藥物設(shè)計(jì)在配基受體結(jié)合點(diǎn)上提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。（3）開(kāi)展對(duì)ESCRT-III蛋白復(fù)合體、hCRP-C1q蛋白復(fù)合體及鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白寡聚體 等膜蛋白復(fù)合體的整體結(jié)構(gòu)的單顆粒解析以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究。其中，ESCRT-III蛋白復(fù)合體（約450kDa）在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的出芽中起關(guān)鍵作用，與阿爾茨海默（AD）病及HIV病毒感染有關(guān)。hCRP-C1q蛋白復(fù)合體由C-反應(yīng)蛋 白和膜上補(bǔ)體蛋白組成，是一種典型的急性期蛋白復(fù)合體，

20、參與人的炎癥反應(yīng)， 在免疫系統(tǒng)反應(yīng)及抑制動(dòng)脈粥狀硬化（AS）發(fā)揮重要功能。而鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道 蛋白寡聚體CorA是參與鎂離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要系統(tǒng)之一，維持細(xì)胞正常的生命 活動(dòng)所必需的。課題三，高對(duì)稱(chēng)性生物大分子復(fù)合體的高分辨結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究生物大分子復(fù)合體的對(duì)稱(chēng)性在自然界中普遍存在，例如十四次對(duì)稱(chēng)的GroEL、七十六次對(duì)稱(chēng)的真核細(xì)胞核蛋白Vault、十二面體對(duì)稱(chēng)的丙酮酸鹽脫氫酶復(fù)合體，八面體對(duì)稱(chēng)的大腸桿菌蛋白 DegP以及和二十面體對(duì)稱(chēng)的很多病毒殼 等。單一生物大分子復(fù)合體中也可能存在多種不同對(duì)稱(chēng)性，如噬菌體的頭部呈二 十面體對(duì)稱(chēng)性，通過(guò)十二或十三次對(duì)稱(chēng)的連接蛋白聯(lián)接六次對(duì)稱(chēng)的尾部。生物大分

21、子復(fù)合體的高對(duì)稱(chēng)性組裝一方面反映了基因信息的高效經(jīng)濟(jì)利用，另一方面也顯示了復(fù)合體功能過(guò)程中的協(xié)同作用機(jī)制。 在客觀(guān)上，這些高對(duì)稱(chēng)性的存在使得 高分辨率結(jié)構(gòu)的獲得變得相對(duì)容易。 例如，具有n次對(duì)稱(chēng)的大分子復(fù)合體在某個(gè) 取向（如果不在m對(duì)稱(chēng)軸線(xiàn)上）的透射電子投影圖像所能獲取的信息也同時(shí)包 含了其它n-1個(gè)對(duì)稱(chēng)相關(guān)方向取向的電子圖像信息；而通過(guò) m對(duì)稱(chēng)軸線(xiàn)的成像， 也同時(shí)包含有（n/m-1）個(gè)其它m對(duì)稱(chēng)軸線(xiàn)方向的信息。在多面體大分子復(fù)合體 的取向和中心位置確定上，目前一個(gè)常用方法是通過(guò)搜索等價(jià)線(xiàn)（ common-line） 的位置來(lái)實(shí)現(xiàn)。高對(duì)稱(chēng)性的存在相應(yīng)增加了與對(duì)稱(chēng)性相關(guān)的等價(jià)線(xiàn)條數(shù)，從而大大提高

22、了等價(jià)線(xiàn)定位的精度。因此，相對(duì)于低對(duì)稱(chēng)或非對(duì)稱(chēng)的樣品，高對(duì)稱(chēng)性樣 品的電鏡圖像的取向和中心位置的確定過(guò)程中誤差大大減少，就有更好機(jī)會(huì)獲得更高分辨率三維結(jié)構(gòu)。本課題的實(shí)施旨在以高對(duì)稱(chēng)性的生物大分子復(fù)合體為研究對(duì)象，繼續(xù)提高冷凍電鏡高分辨結(jié)構(gòu)解析的能力，并開(kāi)展結(jié)構(gòu)和功能相互關(guān)系的研究。a.獲得一系列高對(duì)稱(chēng)性生物大分子復(fù)合體的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并爭(zhēng)取獨(dú)立 構(gòu)建近原子級(jí)分辨率模型（1）以腸道病毒71型、重組人杯狀病毒殼和重組 EB病毒殼等為研究對(duì)象， 開(kāi)展對(duì)這些具有二十面體對(duì)稱(chēng)性的病毒殼的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的解析。這些都是重要的人類(lèi)病毒，其中腸道病毒 71型在嬰幼兒中引發(fā)手足口病、神經(jīng)系統(tǒng)疾 病甚至

23、死亡，人杯狀病毒引起急性傳染性腹瀉，而EB病毒與中國(guó)南方高發(fā)的鼻煙癌緊密相關(guān)。（2）以狂犬病毒的核殼蛋白十聚體等為研究對(duì)象，開(kāi)展非二十面 體的高對(duì)稱(chēng)性復(fù)合體的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)解析。（3）以皰疹病毒等為研究對(duì)象，對(duì)高對(duì)稱(chēng)性復(fù)合體的局部非高對(duì)稱(chēng)性結(jié)構(gòu)（如皰疹病毒的Portal）展開(kāi)冷凍電鏡三維重構(gòu)研究。當(dāng)重構(gòu)分辨率不足以建立原子模型的時(shí)候， 參照同源蛋白和所獲 得的三維結(jié)構(gòu)密度圖進(jìn)行準(zhǔn)原子模型的構(gòu)建。（4）針對(duì)以上具有不同對(duì)稱(chēng)性的結(jié)構(gòu)解析，探索開(kāi)發(fā)高對(duì)稱(chēng)性復(fù)合體三維重構(gòu)的新方法。如針對(duì)較大尺度的高對(duì) 稱(chēng)性大分子復(fù)合體的高分辨率結(jié)構(gòu)研究； 還希望利用不同的對(duì)稱(chēng)匹配函數(shù)（如二 十面體、八面體、四面體及

24、二面體對(duì)稱(chēng)匹配函數(shù)），對(duì)電鏡數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，并充 分利用生物大分子復(fù)合體的對(duì)稱(chēng)性，達(dá)到有效抑制噪聲，最終提高分辨率的作用。b.構(gòu)建具高對(duì)稱(chēng)性的生物大分子復(fù)合體在不同生理狀態(tài)或功能狀態(tài)下的高分辨時(shí)空模型利用冷凍電鏡制樣能夠保持生物大分子生理狀態(tài)下結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，通過(guò)生物化學(xué)手段，對(duì)不同生理狀態(tài)下的同一生物大分子進(jìn)行分離，解析其在不同生理過(guò)程中的高分辨三維結(jié)構(gòu)；觀(guān)察蛋白結(jié)構(gòu)域的變化，在分子或者氨基酸殘基的水平上 研究蛋白結(jié)構(gòu)功能間的相互聯(lián)系；并針對(duì)某些氨基酸殘基加以突變，觀(guān)察其三維 結(jié)構(gòu)變化，研究其在大分子功能中所起的作用。本研究將以腸道病毒71型等為研究對(duì)象，獲得在不同生理狀態(tài)和功能狀態(tài)的三維重構(gòu)，并

25、構(gòu)建它們的高時(shí)空分辨率模型。腸道病毒71型是在酸性的腸道中開(kāi)始其細(xì)胞感染過(guò)程的，但病毒致 病和病理發(fā)生很多是在偏中性的神經(jīng)細(xì)胞中進(jìn)行的。因此需要了解不同生理環(huán)境下該病毒的結(jié)構(gòu)變化以及病毒感染和病理發(fā)生的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。另外，目前對(duì)該病毒的中和性抗原位點(diǎn)在病毒殼上的定位以及抗體中和的機(jī)制尚不清楚。通過(guò)獲取病毒在不同生理狀態(tài)下以及和中和性單抗 Fab的復(fù)合體的高時(shí)空分辨率結(jié)構(gòu)，就 可以準(zhǔn)確定位中和性抗原位點(diǎn)，揭示抗體中和的分子機(jī)制。這方面的研究將為制 備廣譜的中和性抗體和優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。課題四，病毒、亞細(xì)胞器和細(xì)胞的高時(shí)空分辨結(jié)構(gòu)及其功能的在體 /原位研究冷凍電子斷層成像方

26、法是目前唯一一個(gè)能在納米水平觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)和相互作用的方法，填補(bǔ)了低分辨率的光學(xué)顯微分析以及原子分辨率的X射線(xiàn)晶體學(xué)之間的空白。同時(shí)，它在保持生物體活性和結(jié)構(gòu)特征細(xì)節(jié)等方面具有 獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本課題的主要研究?jī)?nèi)容是a.冷凍電子斷層成像的高通量數(shù)據(jù)收集以及電子斷層圖像的自動(dòng)處理和高精度三維重構(gòu)的方法研究對(duì)于具有結(jié)構(gòu)同一性的蛋白、病毒及其復(fù)合物等的三維重構(gòu)，可采用課題一 至三中的單顆粒重構(gòu)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。但對(duì)沒(méi)有結(jié)構(gòu)同一性的病毒及其復(fù)合 物，以及細(xì)胞器和細(xì)胞水平下的蛋白質(zhì)相互作用的三維結(jié)構(gòu)解析，只能采用電子斷層成像方法通過(guò)獲取同一區(qū)域的多個(gè)角度的投影圖來(lái)反向重構(gòu)它們的三維結(jié) 構(gòu)。電子斷層

27、成像數(shù)據(jù)采集時(shí)傾轉(zhuǎn)樣品臺(tái)，存在兩個(gè)問(wèn)題需要解決：第一，由于儀器樣品臺(tái)只能傾轉(zhuǎn)到有限的角度 與0 ,導(dǎo)致士(70 -90 )的數(shù)據(jù)缺失，此即所 謂數(shù)據(jù)失錐問(wèn)題“(missing cone problem)；第二，由于樣品臺(tái)傾轉(zhuǎn)，導(dǎo)致樣品 不同區(qū)域相對(duì)于焦點(diǎn)具有不同的高度，因此受不同的襯度傳遞函數(shù)( contrast transfer function)調(diào)制。目前常用的結(jié)構(gòu)解析方法還沒(méi)有很好地處理這兩個(gè)問(wèn)題， 限制了結(jié)構(gòu)解析的分辨率。我們將在課題進(jìn)行過(guò)程中對(duì)這兩個(gè)問(wèn)題進(jìn)行深入的研 究，采用雙軸傾轉(zhuǎn)等方法盡量克服“數(shù)據(jù)失錐問(wèn)題”的影響，并對(duì)不同高度的區(qū) 域進(jìn)行襯度函數(shù)校正。同時(shí)，我們將充分結(jié)合電子斷

28、層成像和單顆粒分析的各種優(yōu)勢(shì)，在用電子斷 層成像方法得到病毒、細(xì)胞器以及細(xì)胞切片等的三維結(jié)構(gòu)后，對(duì)其中具有重要生 物學(xué)意義的重復(fù)亞單元利用單顆粒分析類(lèi)似的方法進(jìn)行三維空間中的多顆粒平 均以及分類(lèi)，以得到這些亞單元的高精度三維結(jié)構(gòu)。本部分可以和課題一的團(tuán)隊(duì)進(jìn)行密切配合與交流。此外，隨著電子顯微鏡硬件設(shè)備的改進(jìn)和電子斷層成像應(yīng)用的越來(lái)越廣泛， 冷凍電子斷層成像的全自動(dòng)、高通量數(shù)據(jù)收集以及圖像的自動(dòng)處理和高效三維重 構(gòu)也有更為迫切的需求。因此，我們?cè)谡n題進(jìn)行過(guò)程中將努力探討新的樣品制備、 數(shù)據(jù)采集、圖像處理和三維重構(gòu)方法，與課題一密切配合并積極采用課題一的最 新研究成果。同時(shí)，我們將發(fā)展 X-ray

29、/NMR數(shù)據(jù)與電子斷層數(shù)據(jù)整合算法，擴(kuò) 展數(shù)據(jù)范圍，并提高結(jié)構(gòu)解析的分辨率。在以上電子斷層的方法學(xué)的研究之上，我們將開(kāi)展以下方面的應(yīng)用工作： b.心肌細(xì)胞內(nèi)部及其鈣火花”分子機(jī)器、肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)分子機(jī)器的在體 /原位三維重構(gòu)心肌細(xì)胞上的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是調(diào)控心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵因素。其基本 單元一鈣火花”的發(fā)放過(guò)程涉及到多種分子的相互作用，比如細(xì)胞表面質(zhì)膜上有電壓門(mén)控L-型鈣離子通道，肌漿網(wǎng)膜上有負(fù)責(zé)鈣釋放的離子通道一ryanodine受體(RyR)。RyR分子排列成二維分子陣列，形成鈣釋放單元(Ca2+ releaseunit/CRU);質(zhì)膜L-型鈣通道與鈣釋放單元耦聯(lián)，形成二聯(lián)體。

30、在心臟收縮期， 由L-型鈣通道的鈣內(nèi)流觸發(fā)鈣釋放，成十倍地放大鈣信號(hào)，這一過(guò)程稱(chēng)之為鈣致鈣釋放”。對(duì)于這樣一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中涉及到的多種分子的三維結(jié)構(gòu)，特別是在心肌細(xì)胞中的這些分子與分子之間如何進(jìn)行相互作用，目前所知甚少。本課題的研究將揭示這些分子機(jī)器對(duì)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)理及調(diào)控機(jī)制及其與生理活 動(dòng)和心力衰竭的關(guān)系，為心臟病的預(yù)防及治療提供指導(dǎo)。c.利用冷凍電子斷層成像方法研究 AIDS病毒、SARSW毒和禽流感病毒等包膜 病毒的結(jié)構(gòu)包膜病毒對(duì)人體靶細(xì)胞的侵蝕都是通過(guò)病毒表面的包膜蛋白（ENV）和位于靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合而引發(fā)的。在針對(duì)這些病毒的疫苗開(kāi)發(fā)中，如何誘發(fā)和 ENV蛋白有效結(jié)合的中和抗

31、體（Neutralizing antibody, Nab）是需要解決的關(guān)鍵 問(wèn)題。這些包膜蛋白在真實(shí)病毒表面的分布和結(jié)構(gòu)信息，它們和receptor/Nab在細(xì)胞生理環(huán)境下如何相互作用，作用位點(diǎn)和方向如何，都所知甚少。本課題將利 用冷凍電子斷層三維重構(gòu)方法研究 AIDS病毒、SARS病毒以及流感病毒等和靶 細(xì)胞受體以及不同結(jié)合位點(diǎn)的中和抗體的在體 /原位相互作用。通過(guò)解析這些重 要疾病相關(guān)的病毒ENV-Receptor/Nab復(fù)合體的高分辨三維結(jié)構(gòu)來(lái)精確定位靶細(xì) 胞受體以及不同的中和抗體在真實(shí)病毒表面的空間位置、作用位點(diǎn)及方向，分析病毒表面抗原的結(jié)構(gòu)組成細(xì)節(jié)。d.利用冷凍電子斷層成像方法研究其

32、它具有重要生物學(xué)意義的大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)除了以上心肌細(xì)胞“鈣火花”分子機(jī)器以及包膜病毒表面結(jié)構(gòu)等，我們還將利用冷凍電子斷層成像方法研究其它具有重要生物學(xué)意義的生物大分子以及 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，如對(duì)表觀(guān)遺傳起重要作用的核小體-蛋白酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及其調(diào)控的結(jié)構(gòu)機(jī)制等。e.開(kāi)展心肌細(xì)胞鈣釋放以及病毒-靶細(xì)胞動(dòng)態(tài)相互作用等重要生物過(guò)程的具有 時(shí)間分辨率的電子斷層研究結(jié)合定點(diǎn)突變等生化手段和快速冷凍的方法， 我們可以將心肌細(xì)胞鈣釋放以 及病毒-細(xì)胞相互作用等重要生物過(guò)程的不同時(shí)間階段（如心肌細(xì)胞鈣釋放的不 同時(shí)間段、病毒-靶細(xì)胞的融合、病毒在細(xì)胞內(nèi)的組裝、成熟以及出芽階段等） 分別

33、制樣并進(jìn)行冷凍電鏡斷層成像。 基于課題一中的方法學(xué)工作，特別是最大似 然法等非監(jiān)督性分類(lèi)方法，對(duì)獲取的不同時(shí)間段的樣品數(shù)據(jù)以及同一時(shí)間段內(nèi)可 能包含的不同構(gòu)象的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重構(gòu)和分類(lèi)，由此獲得心肌細(xì)胞的鈣釋放 過(guò)程和病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程在不同時(shí)間段的動(dòng)態(tài)形態(tài)。 通過(guò)對(duì)這些動(dòng)態(tài)變化 過(guò)程的可視化研究，開(kāi)展對(duì)鈣釋放過(guò)程以及病毒 -靶細(xì)胞的融合與復(fù)制過(guò)程的動(dòng) 力學(xué)及其調(diào)控因素的研究。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)是當(dāng)今國(guó)際生命科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。本項(xiàng)目將致力于探索相關(guān)生命過(guò)程中的重大科學(xué)問(wèn)題，培養(yǎng)一批冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)人 才，推動(dòng)中國(guó)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)入世界領(lǐng)先水平。我們的

34、總體目標(biāo)是集中力量開(kāi)發(fā)全自動(dòng)化、高通量的冷凍電子顯微學(xué)方法，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展對(duì)重要 生物大分子復(fù)合體（如核糖體、膜蛋白、病毒等）的高時(shí)空分辨的功能態(tài)結(jié)構(gòu)的 解析，同時(shí)開(kāi)展基于電子斷層成像方法的在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的實(shí)時(shí)在體研 究。五年預(yù)期目標(biāo).建立一流的冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)平臺(tái)，開(kāi)發(fā)全自動(dòng)化、高通量冷凍電鏡數(shù)據(jù) 采集系統(tǒng)、高性能并行化的圖像處理和三維重構(gòu)方法，以及解決結(jié)構(gòu)不均一 性的電鏡數(shù)據(jù)分類(lèi)方法。.利用單顆粒重構(gòu)方法，解析若干個(gè)與重要生命活動(dòng)及重大疾病相關(guān)的生物大 分子復(fù)合體的高分辨的功能態(tài)結(jié)構(gòu)，包括原核和真核細(xì)胞各功能態(tài)下的核糖 體，IL-1家族細(xì)胞因子與受體三元復(fù)合物，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體等膜

35、蛋白相關(guān)復(fù) 合物，具有二十面體對(duì)稱(chēng)性的病毒殼（如腸道病毒 71型，重組人杯狀病毒殼 等），非二十面體對(duì)稱(chēng)性的病毒蛋白復(fù)合體（如水庖性口炎病毒的核殼蛋白 多聚體等），以及具有局部低對(duì)稱(chēng)性病毒等。.利用電子斷層成像方法利用電子斷層成像方法，進(jìn)行正常的細(xì)胞生理環(huán)境下蛋白-蛋白、病毒-分子、以及病毒-細(xì)胞等相互作用的可視化研究，構(gòu)建一些 與重要生命現(xiàn)象或重大疾病相關(guān)的生命過(guò)程的高精度三維結(jié)構(gòu)模型。解析心肌細(xì)胞“鈣火花”分子機(jī)器、包膜病毒表面分子及其復(fù)合物、以及核小體-修飾酶等其它具有重要生物學(xué)意義的大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。.在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域培養(yǎng)一支高水平科研隊(duì)伍。培養(yǎng)一批優(yōu)秀的碩士研究生，

36、博士研究生和博士后研究人員。.研究成果主要以研究論文形式公布，擬在一流國(guó)際刊物上發(fā)表學(xué) 術(shù)論文30篇以上。三、研究方案1、總體思路本課題的中心學(xué)術(shù)思想是依據(jù)國(guó)家 2006-2020年中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃 綱要中的 蛋白質(zhì)研究”重大計(jì)劃，集中力量發(fā)展冷凍電子顯微學(xué)這一具有高度潛 力的結(jié)構(gòu)生物學(xué)新技術(shù)和新方法。對(duì)一系列重要的生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功 能展開(kāi)研究，力爭(zhēng)獲取它們?cè)诟鞴δ軤顟B(tài)下的冷凍電鏡高時(shí)空分辨結(jié)構(gòu)，進(jìn)而闡明這些重要生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。本項(xiàng)目課題1致力于突破高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的限制因素，積極展開(kāi)方法學(xué)領(lǐng)域的研究，開(kāi)發(fā)全自動(dòng)化、 高通量冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集和三維重構(gòu)

37、圖像處理方法。在課題1的基礎(chǔ)上，課題2將利用單顆粒三維重構(gòu)方法解析若干個(gè)與重要生命過(guò)程相關(guān)的低對(duì)稱(chēng)或非對(duì)稱(chēng) 性的生物大分子復(fù)合體（包括細(xì)胞內(nèi)可溶的大分子復(fù)合體， 以及一些重要膜蛋白 或者與膜相關(guān)聯(lián)的蛋白）的高分辨結(jié)構(gòu)，尤其是與它們的動(dòng)態(tài)過(guò)程直接聯(lián)系的各 種功能態(tài)的結(jié)構(gòu)，并同時(shí)開(kāi)展相關(guān)的生理功能性的研究； 課題3致力于解析一系 列重要的高對(duì)稱(chēng)性病毒大分子的準(zhǔn)原子分辨率結(jié)構(gòu)（3-4?）,并獨(dú)立構(gòu)建分子模 型，進(jìn)而揭示這些病毒大分子的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化和功能的關(guān)系。課題4將利用冷凍 電子斷層成像方法，重構(gòu)一系列病毒、亞細(xì)胞器和細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，開(kāi)展重要的 在體/原位研究工作。課題1重點(diǎn)是理論方法上的研究和突

38、破，它的研究成果將 為課題2-4提供方法基礎(chǔ)；課題2-3是在分子層次上研究；課題 4是細(xì)胞和亞細(xì) 胞層次上的研究。這四個(gè)課題既相互關(guān)聯(lián)，又相互獨(dú)立。參與本項(xiàng)目的清華大學(xué)、中科院上海巴斯德研究所、中科院生物物理所、以 及北京大學(xué)是我國(guó)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中心。我們將發(fā)揮各自?xún)?yōu)勢(shì)，重點(diǎn)突破，共同協(xié)作，促進(jìn)我國(guó)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)步， 盡快使我國(guó)的結(jié)構(gòu)生物 學(xué)研究達(dá)到世界領(lǐng)先水平，并培養(yǎng)出一批冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)的杰出人才。2、技術(shù)途徑1）本項(xiàng)目采取多學(xué)科相互交叉、滲透和有機(jī)結(jié)合的途徑，以冷凍電子顯微學(xué)為 主，結(jié)合應(yīng)用數(shù)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、信息科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等，開(kāi)發(fā)全自動(dòng)、 高通量冷凍電子顯微學(xué)

39、方法；2）本項(xiàng)目采用理論研究與實(shí)驗(yàn)科學(xué)相結(jié)合的策略，理論研究（課題1）的成果指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)科學(xué)（課題2-4）,實(shí)驗(yàn)科學(xué)中遇到的問(wèn)題反過(guò)來(lái)推動(dòng)理論研究，兩 者互相促進(jìn)；3）本項(xiàng)目采用一般性與特殊性相結(jié)合的策略，既保證課題的相對(duì)獨(dú)立，又保證 課題的相互協(xié)調(diào)。對(duì)于所有課題都存在的一般性問(wèn)題，如樣品的冷凍制備和 數(shù)據(jù)采集問(wèn)題，所有課題同時(shí)進(jìn)行，一旦有一個(gè)課題組成功，其它課題組可 借鑒成功的經(jīng)驗(yàn)，加快課題的進(jìn)度；而對(duì)課題專(zhuān)一的特殊性問(wèn)題，如圖像處 理問(wèn)題和結(jié)構(gòu)解析問(wèn)題，則分別進(jìn)行，各個(gè)擊破；4）本項(xiàng)目課題由分子層次到細(xì)胞與組織層次，由簡(jiǎn)單到復(fù)雜，循序漸進(jìn)，確保 項(xiàng)目成功；5）離體（in vitro）和在體（in vivo）研究相結(jié)合。一方面在