水稻種子產(chǎn)地檢疫規(guī)程

1、水稻種子產(chǎn)地檢疫規(guī)程GB 837187本規(guī)程適用于水稻種子繁育基地的產(chǎn)地檢疫。1名詞解釋1.1產(chǎn)地檢疫：系指水稻種子生產(chǎn)過程中的檢疫。包括選擇基地、選用無病良種、生長期間檢查、必要的 室內(nèi)檢驗(yàn)等，直到簽發(fā)“產(chǎn)地檢疫合格證書”。1.2檢疫對象：指國家法律規(guī)定禁止隨稻種、秧苗、植株殘?bào)w等人為傳播的危險(xiǎn)病蟲。2檢疫對象水稻細(xì)菌性條斑病 Xanthomonas Campestris pv. Oryzicola (Fang et al)Dye.水稻白葉枯病 Xanthomonas Campestris pv.Oryzae ( ISHIYAMA)Dye.3 選擇基地從未發(fā)生或連續(xù)三年未發(fā)生檢疫對象，有一定

2、隔離保護(hù)條件，灌溉水源無檢疫對象污染。4基地用種要求4.1基地用種應(yīng)在無檢疫對象發(fā)生地區(qū)選種或經(jīng)檢疫部門檢驗(yàn)證明不帶檢疫對象的種子。4.2播種前必須對種子進(jìn)行消毒處理(詳見附錄A)。5綜合治理措施5.1栽培管理要求5.1.1秧田要選擇在灌水系統(tǒng)上游，距村莊較遠(yuǎn)的地勢高燥的地方。5.1.2捆秧苗用稻草要沸水消毒30min，或用麥草、棕葉等代替。5.1.3在秧田三葉期和移栽前35天用藥劑防治12次。5.1.4灌水5.1.4.1排灌分家。5.1.4.2淺水勤灌，嚴(yán)防串灌、深水淹灌、浸灌，及時(shí)曬田。5.1.5施肥5.1.5.1基肥充分腐熟。5.1.5.2防止偏施氮肥，氮、磷、鉀要合理配比，防止水稻貪青

3、誘發(fā)病害。病田處理5.2.1對發(fā)病田塊和發(fā)病中心插上標(biāo)記。5.2.2化學(xué)防治：田間一旦發(fā)現(xiàn)病中心，立即拔除或齊泥割除病株，噴藥控制，對周圍田塊也應(yīng)噴藥預(yù)防， 特別是在暴風(fēng)雨及淹澇之后，要立即噴藥。5.3病田稻種處理 5.3.1病田生產(chǎn)的種子要單收、單存，嚴(yán)防與無病種子混雜。5.3.1.1輕病田（只有零星病葉）的種子必須經(jīng)消毒處理后嚴(yán)格控制在病區(qū)使用（種子消毒處理方法見條）。5.3.1.2其它病田種子一律改做糧食不準(zhǔn)作種用。5.4病稻草處理：病稻草作燃料燒掉，或作其他滅菌處理。不得用病稻草捆秧和禁止帶病肥料施入稻田。6檢查、檢驗(yàn)方法6.1田間檢查6.1.1 田間檢查時(shí)間6.1.1.1秧田從四葉期

4、開始，逐畦目測檢查，發(fā)現(xiàn)可疑病斑，拔出病苗，進(jìn)行鑒定。6.1.1.2本田期檢查三次：第一次在拔節(jié)期；第二次在孕穗至抽穗階段，多為病害流行時(shí)期，癥狀明顯， 易于識別；第三次在齊穗后至葉片枯黃前，結(jié)合種子純度、質(zhì)量檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。6.1.2田間檢查方法6.1.2.1檢查方法：種子田逐塊、逐帶檢查（包括隔離區(qū)）。6.1.2.2癥狀診斷：田間癥狀識別（詳見附錄B）。可疑癥狀，采集標(biāo)本帶回室內(nèi)鑒定。6.2室內(nèi)檢驗(yàn)方法6.2.1細(xì)菌溢檢查：切取病葉上病健交界處葉片組織約1毫米，放在載玻片的水滴中，加上蓋玻片，靜止 12min后，用手持?jǐn)U大鏡或低倍顯微鏡稍暗視野下檢查，有云霧狀菌液自葉脈涌出。6.2.2保濕檢

5、查：取玻璃杯一只，內(nèi)盛清潔河沙約半寸深，加水濕潤，再切取病葉組織約6.6cm，下端插 入河沙中，上端外露，加蓋濕紗布，保濕12h以上，上端切口處有混濁液或淡黃色菌珠形成。6.2.3染色檢查：將病葉莖部剪去，插入盛有紅墨水（原液或加稀釋）的玻管或廣口瓶中，放在通風(fēng)而溫 暖的地方，30min后，健部染成紅色，病部因?qū)Ч軆?nèi)充滿細(xì)菌，影響紅墨水進(jìn)入，仍為綠色或黃色。6.2.4分離培養(yǎng)檢驗(yàn)：對病組織進(jìn)行分離培養(yǎng)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)（詳見附錄C）。6.3帶菌種子檢驗(yàn)：用噬菌體方法或免疫熒光檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)種子帶菌情況（詳見附錄D）。7簽發(fā)證書7.1經(jīng)最后一次田間檢查后，未發(fā)現(xiàn)檢疫對象的水稻種子，由當(dāng)?shù)貦z疫部門簽發(fā)“產(chǎn)地

6、檢疫合格證”（見 附錄E）。7.2凡發(fā)生有檢疫對象的種子田生產(chǎn)的種子不發(fā)給“產(chǎn)地檢疫合格證”。7.3種子部門憑“產(chǎn)地檢疫合格證”收購無病種子。附錄A水稻種子消毒處理方法 （參考件）A1細(xì)菌性條斑病、白葉枯病。A1.1熱水燙種：將稻種盛在籮筐內(nèi)，先放到45的溫水中預(yù)熱3min，立即移入保持58C的熱水中浸泡 10min。將稻谷取出后立即用冷水沖洗冷卻再浸種催芽或曬干待播。A1.2 80%“402” 1000倍（或10%“401” 500倍）+0.4%鹽酸（化學(xué)純）浸種36h。（注：根據(jù)大田應(yīng) 用結(jié)果，浸種時(shí)間36h比較安全。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，各地應(yīng)對不同品種作發(fā)芽試驗(yàn)后，方可應(yīng)用）。A1.3 氯霉素5

7、00ppm浸種48h （水溫2528C）。附錄B田間癥狀識別（補(bǔ)充件）B1 水稻細(xì)菌性條斑病水稻細(xì)菌性條斑病在葉片上形成暗綠色或黃褐色的狹窄條斑。初發(fā)期為暗綠色水漬狀半透明小斑點(diǎn)， 很快在葉脈之間伸展，形成寬約1/33/4mm，長約14mm的條斑，可擴(kuò)大到寬1mm、長10mm以上，轉(zhuǎn)為 黃褐色。病斑上帶有成串的黃色珠狀細(xì)菌溢出，形小而量多。嚴(yán)重時(shí)，病斑增多而融聚一起，局部呈不規(guī) 則的黃褐色 至枯白斑塊，對光觀察，病斑部半透明，水浸狀。病部菌膠多，色深，不易脫落。秧苗期即可 見到典型癥狀。B2 水稻白葉枯病B2.1 典型白葉枯病癥狀典型白葉枯病癥狀主要發(fā)生在葉片及葉鞘部位，病菌自葉片的葉尖或葉緣

8、入侵后先產(chǎn)生黃綠色、水漬 狀條斑紋斑點(diǎn)，后沿葉緣一側(cè)或兩側(cè)，或葉片中脈繼續(xù)發(fā)展成為波紋狀黃色、黃綠色或灰綠色病斑；病、 健組織界線明顯，病斑數(shù)天后轉(zhuǎn)灰白色，并向內(nèi)卷曲，遠(yuǎn)望一片枯槁色。在空氣濕度大或雨后的傍晚和清 晨露點(diǎn)大時(shí)，病葉上的新鮮病斑上，有時(shí)甚至在未表現(xiàn)病斑的葉緣上吐出混濁狀的水珠或蜜黃色膠珠狀的 細(xì)菌膿，干涸后硬結(jié)成粒，易脫落。在一些感病品種上，病斑可以從葉片向下擴(kuò)展至葉鞘，如黃白色轉(zhuǎn)為 灰白色，葉鞘最終亦變呈干枯。B2.2雕萎型白葉枯病癥狀雕萎型白葉枯病癥狀主要發(fā)生于秧田及移植前后，幼株感病后，在秧苗生育后期或本田移植后1至4 周內(nèi)，能陸續(xù)表現(xiàn)癥狀。癥狀的產(chǎn)生主要是病原菌自葉面?zhèn)?/p>

9、、自然孔口、傷莖或斷根等部位入侵，在稻 田內(nèi)沿維管束向其他器官部位轉(zhuǎn)移，分泌毒素破壞并堵塞輸導(dǎo)組織而引起秧田失水，整株雕萎。雕萎株發(fā) 生前期，病菌的入侵點(diǎn)（葉尖水孔或傷口）上先出現(xiàn)水漬狀灰綠色急性型病斑，而后迅速沿主脈向下擴(kuò)展 至葉鞘，感病葉片及葉鞘很快干枯，甚至死亡脫落，710天后便出現(xiàn)雕萎株、心葉卷曲、形似暝害枯心， 但只要把枯萎株拔起，剝開枯萎心葉，剖視病株假莖褐變部位，并用手?jǐn)D壓斷口，可見大量黃白色至黃色 涕狀菌膿溢出，剝視病株葉鞘內(nèi)側(cè)，亦常見有大量菌膿溢出。病菌如從莖部或斷根以及自根點(diǎn)伸長的新根 所穿破的鞘 部傷口入侵時(shí)，能迅速直接入侵心葉或假莖組織。雕萎出現(xiàn)早，莖部葉片或心葉都可因

10、癥狀發(fā) 展嚴(yán)重而先后卷曲；但有時(shí)往往在伸長的心葉上傷口處出現(xiàn)葉枯型病斑。雕萎癥狀與典型白葉枯癥狀可以 相互轉(zhuǎn)化，單獨(dú)發(fā)生或同時(shí)并發(fā)。B2.3黃葉型癥狀黃葉型癥狀多見于成株上的心部新葉，得病后呈淡黃至青黃色；而其他下位葉片呈正常綠色。在黃葉 型的病葉上，一般難以檢出細(xì)菌；但在感染的葉片下方的節(jié)間及假莖部則大量帶菌，在尚未足以破壞莖節(jié) 的輸導(dǎo)組織時(shí)，仍能為幼葉供應(yīng)少量養(yǎng)分，致使葉片呈半死不活的淡黃色狀態(tài)。附錄C細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法（補(bǔ)充件）水稻白葉枯病細(xì)菌和條斑病菌的分離方法與一般植物病原細(xì)菌的分離方法相同，只是在培養(yǎng)基中以蔗 糖代替葡萄糖，分離后的培養(yǎng)皿先在2025C溫箱中存放一天以后轉(zhuǎn)入2729C的

11、溫箱中培養(yǎng)，而菌落的 出現(xiàn)一般都要37天以后。在細(xì)菌的生理生化反映方面，條斑病菌與白葉枯病菌基本相似，但有幾個(gè)顯著區(qū)別：（1）明膠液化： 白葉枯病菌不能液化；條斑病菌能液化明膠。（2）牛乳培養(yǎng)：白葉枯病菌不能胨化，條斑病菌可以胨化。（3）阿拉伯糖發(fā)酵：白葉枯病菌不能利用，不產(chǎn)酸；條斑病菌可以利用而產(chǎn)酸。（4）白葉枯病菌對還原物 質(zhì)敏感，在2%葡萄糖的培養(yǎng)基上不能生長；條斑病菌對還原物質(zhì)不敏感，在2%葡萄糖培養(yǎng)基上可以生長。（5）兩者的血清反應(yīng)和噬菌體反應(yīng)各不相同。附錄D帶菌種子的檢驗(yàn)法（補(bǔ)充件）D1 噬菌體檢驗(yàn)法D1.1檢驗(yàn)時(shí)間：被檢驗(yàn)稻種在收獲后的三個(gè)月內(nèi)進(jìn)行。D1.2樣品的制備：多點(diǎn)取樣稻

12、種，經(jīng)充分混合后隨機(jī)稱取10g種子，脫下谷殼，磨碎后放入消毒過的燒 杯或研缽中，加滅菌水20mL，浸泡并時(shí)常攪拌，半小時(shí)后吸取上層清液供測定用，也可用粗濾紙過濾除去 組織殘余，取濾液測定。D1.3指示菌液的制備：使用OS-3 （江蘇）和OS-14 （遼寧）兩個(gè)菌株作混合指示菌（各地在檢驗(yàn)本地種 子材料時(shí)，也可用本地的菌種），要保證指示菌的純度，指示菌要使用新鮮培養(yǎng)的，尤以斜面培養(yǎng)的為好， 一般以移植在斜面上生長35天的菌為最好，超過10天以上的不宜使用。指示菌懸浮液濃度不宜過稀， 以每毫升含菌量在9億以上為好。在每管斜面菌種管中，加5mL滅菌水，刮下菌苔，配制成細(xì)菌懸浮液， 作測定用。D1.4

13、測定及計(jì)數(shù)：每個(gè)樣品，分別吸取上層溶液1.0、1.0、0.5mL于三個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中，各加1mL指示 菌液和10mL溶化的固體培養(yǎng)基，搖勻凝成平板后，放在2528C的溫箱中，培養(yǎng)1012h后，記載各個(gè) 培養(yǎng)皿中的噬菌斑數(shù)，然后再換算成每克種子內(nèi)的噬菌斑數(shù)。D2熒光抗體檢驗(yàn)法D2.1熒光抗體法檢驗(yàn)水稻白葉枯病種操作程序D2.1.1熒光片的制備D2.1.1.1稱取5g干稻種（最好收獲后一年以內(nèi)），脫殼備用。D2.1.1.2將稻殼放在大試管內(nèi)，加生理鹽水1015mL，以沒過稻殼為準(zhǔn)，用玻棒攪勻，放28C溫箱孵育 2h。D2.1.1.3將稻殼水?dāng)嚢韬鬄V出棄殼，稻殼水放離心管內(nèi)，以1000r/min離心5

14、min，棄去沉淀物，留上清 液。D2.1.1.4將上清液放離心管內(nèi)，以4000r/min離心30min，用吸管棄去上清液，留底部富集菌液0.5mL。D2.1.1.5以富集菌液在載片上涂去，陰干并在酒精燈火焰上迅速過12次，使菌固定于載片。D2.1.1.6用1 ： 1015白葉枯抗血清蓋滿載片上細(xì)菌涂片區(qū)，將載片水平放在37C密閉水溶箱內(nèi)，保濕 30min。D2.1.1.7取出上項(xiàng)載片，用磷酸緩沖液沖出多余的抗血清，然后陰干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。D2.1.1.8在上項(xiàng)載片細(xì)菌涂片區(qū)加滴1 ： 15羊抗兔熒光抗體，蓋滿涂片區(qū)，水平放37C水溶箱30min同 刖。D2.1.1.9取出載片、用磷酸緩沖液沖洗熒光抗體，陰干或吹風(fēng)機(jī)吹干載片，備用。D2.1.2熒光片的檢驗(yàn)（在暗室內(nèi)進(jìn)行）D2.1.2.1在熒光片涂菌區(qū)滴一滴pH為8的緩沖甘油（或無熒光鏡油）。D2.1.2.2用熒光濕微鏡100X物鏡對準(zhǔn)載片涂菌區(qū)，小心地使鏡頭接觸到玻片。D2.1.2.3觀察目鏡，用細(xì)調(diào)螺旋使物鏡緩緩上移，待目鏡中較明亮?xí)r，注意觀察在暗景載片上有黃綠色 明亮菌體，選10個(gè)點(diǎn)統(tǒng)計(jì)白葉枯菌體（短桿狀，較粗肥）（種子帶菌量與田間發(fā)病關(guān)系須進(jìn)一步研究）。注：稀釋抗血清和熒光抗體用0.8%滅菌的生理鹽水。D2.2試劑配方D2.2.1 pH8.0緩沖甘