酶的化學修飾市公開課獲獎課件

1、退出 Enzyme Engineering酶工程第1頁第1頁第五章 酶化學修飾第一節(jié) 概述 第二節(jié) 酶分子化學修飾辦法學 第三節(jié) 酶分子側(cè)鏈基團化學修飾 第四節(jié) 有機大分子對酶修飾 第五節(jié)金屬離子置換修飾及物理修飾第六節(jié) 酶化學修飾應用 第2頁第2頁第一節(jié) 概述 一、 概念二、 進行化學修飾原因三、 化學修飾基本原理四、 修飾酶特點 第3頁第3頁一、概念 酶化學修飾 利用各種修飾劑含有化學基團，與酶分子上某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學反應，使酶分子結(jié)構發(fā)生改變，從而改變酶一些特性和功效技術修飾酶 在體外用一定化學辦法將酶和一些試劑進行共價連接后而形成酶體外改造第4頁第4頁二、 進行化學修飾原因穩(wěn)定性不

2、夠，不能適應大量生產(chǎn)需要作用最適條件不符，活性不高臨床應用特殊要求：也許含有抗原性第5頁第5頁三、 化學修飾基本原理1、如何增強酶天然構象穩(wěn)定性與耐熱性2、如何保護酶活性部位與抗克制劑3、如何維持酶功效結(jié)構完整性與抗蛋白 水解酶4、如何消除酶抗原性及穩(wěn)定酶微環(huán)境第6頁第6頁四、 修飾酶特點1、熱穩(wěn)定性增長2、增長抗克制劑、抗蛋白水解酶能力，體 內(nèi)半衰期延長3、消除了酶抗原性4、微環(huán)境穩(wěn)定性增強，最適pH改變5、酶學性質(zhì)改變第7頁第7頁第一節(jié)結(jié)束概念進行化學修飾原因 化學修飾基本原理修飾酶特點第8頁第8頁第一節(jié)結(jié)束點擊返回 第9頁第9頁第二節(jié) 酶分子化學修飾辦法學 一、 修飾需考慮問題二、 選擇

3、酶分子修飾劑三、 修飾反應普通程序四、 測定修飾程度和修飾部位五、 酶修飾辦法第10頁第10頁一、 修飾需考慮問題1、 酶性質(zhì)理解 (1) 酶活性部位情況 (2) 酶穩(wěn)定條件、酶反應最適條件 (3) 酶分子側(cè)鏈基團化學性質(zhì)及反應活 潑性等第11頁第11頁一、 修飾需考慮問題2、 選擇反應條件 (1) 反應體系中酶與修飾劑分子百分比 (2) 反應體系溶劑性質(zhì)，pH條件和離子強度 (3) 反應溫度及時間 (4) 其它第12頁第12頁二、 選擇酶分子修飾劑修飾劑須具備特性1、 能選擇性地與一個氨基酸殘基反應2、 反應在確保酶蛋白不變性條件下進行 3、 被標識殘基在肽中穩(wěn)定，容易通過降解分離 出來并鑒

4、定4、 反應程度能用簡樸技術測定第13頁第13頁二、 選擇酶分子修飾劑修飾劑選擇1、 修飾劑相對分子質(zhì)量、修飾劑鏈長度對蛋 白質(zhì)吸附性2、 修飾劑上反應基團數(shù)目及位置3、 修飾劑上反應基團活化辦法與條件第14頁第14頁三、 修飾反應普通程序修飾反應 終止 稀釋 陽離子互換 洗滌 過濾 干燥第15頁第15頁三、 修飾反應普通程序注意事項修飾后需進行總氨基酸分析各種酶分子，修飾后均需對每個氨基酸殘基進行擬定注意緩沖液成份或修飾副產(chǎn)物對修飾部位和修飾程度及對酶活性影響修飾后酶性質(zhì)改變第16頁第16頁四、 測定修飾程度和修飾部位修飾反應評價原因1、 有多少修飾劑已結(jié)合到酶分子上2、 哪些氨基酸被修飾，

5、修飾度是多少3、 有多少種不同形式修飾劑酶分子耦合物， 每種各有多少4、 表面修飾、內(nèi)部修飾 測定方法第17頁第17頁五、 酶修飾辦法側(cè)鏈基團化學修飾大分子結(jié)合修飾其它(金屬離子置換修飾、物理修飾)第18頁第18頁第二節(jié)結(jié)束酶分子性質(zhì)理解選擇酶分子修飾劑選擇反應條件修飾反應要注意其它問題修飾反應普通程序測定修飾程度和修飾部位酶修飾辦法第19頁第19頁第二節(jié)結(jié)束點擊返回 第20頁第20頁第三節(jié) 酶分子側(cè)鏈基團化學修飾 一、 概述二、 幾種主要修飾反應 三、 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團化學修飾第21頁第21頁一、 概述側(cè)鏈基團修飾 采用一定辦法(普通為化學法)使酶分子側(cè)鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶分子特

6、性和功效修飾辦法酶側(cè)鏈基團 構成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上功效團。有氨基、羧基、巰基、咪唑基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等第22頁第22頁一、 概述作用研究各基團作用及其對酶結(jié)構、特性和功效影響(研究酶活性中心必需基團)改變酶分子性質(zhì)，提升實用價值測定某一基團在酶分子中數(shù)量取得新酶種第23頁第23頁一、 概述類別蛋白類酶核酸類酶 側(cè)鏈基團：磷酸基，核糖上羥基，嘌呤、嘧啶堿基上氨基和羥基(酮基)等第24頁第24頁二、 幾種主要修飾反應 ?；捌湎嚓P反應 烷基化反應 氧化還原反應 芳香環(huán)取代反應第25頁第25頁?；捌湎嚓P反應第26頁第26頁烷基化反應 第27頁第27頁氧化和還原反應 第28頁第2

7、8頁芳香環(huán)取代反應 定量測定第29頁第29頁三、 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團化學修飾巰基氨基羧基咪唑基胍基二硫鍵第30頁第30頁1、 巰基化學修飾 巰基：許多酶活性中心催化基團；形成二硫 鍵，穩(wěn)定酶結(jié)構巰基含有很強親核性，采用巰基修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶空間構象、特性和功效。提升酶穩(wěn)定性慣用：?；?、烷基化劑、馬來酰亞胺、二硫蘇 糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉第31頁第31頁第32頁第32頁2、 氨基化學修飾 氨基甲基化與乙?；?賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺側(cè)鏈氨基；谷氨酰胺和天冬氨酸羧基-OH上 甲基轉(zhuǎn)移酶氨基烷基化 脫氨基作用或與氨基共價結(jié)合，屏蔽酶分

8、子側(cè)鏈上氨基 修飾劑：亞硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯第33頁第33頁第34頁第34頁3、羧基化學修飾 修飾劑與酶分子側(cè)鏈羧基進行酯化、酰基化等反應修飾劑：碳化二亞胺、重氮基乙酸鹽、乙醇-鹽酸試劑、異噁唑鹽等第35頁第35頁第36頁第36頁4、 咪唑基化學修飾 組氨酸。許多酶活性中心必需基團修飾劑通過咪唑基氮原子烷基化或碳原子親核取代進行修飾修飾劑：碘乙酸、焦碳酸二乙酯第37頁第37頁第38頁第38頁5、 胍基化學修飾 精氨酸。在結(jié)合帶有陰離子底物酶活性部位中起主要作用一些二羰基化合物在中性或弱堿性條件下與精氨酸胍基生成穩(wěn)定雜環(huán)

9、修飾劑：丁二酮、1,2-環(huán)己二酮、丙二醛、苯乙二醛等第39頁第39頁第40頁第40頁6、 二硫鍵化學修飾 同巰基基團類似還原辦法與巰基修飾辦法結(jié)合，制止再氧化成二硫鍵?？捎糜谟嬎銛嗔讯蜴I數(shù)目修飾劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、過甲酸等第41頁第41頁第42頁第42頁第三節(jié)結(jié)束酰化及其相關反應 烷基化反應 氧化還原反應 芳香環(huán)取代反應巰基化學修飾 氨基化學修飾 羧基化學修飾 咪唑基化學修飾 胍基化學修飾 二硫鍵化學修飾概述 幾種主要修飾反應 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團化學修飾第43頁第43頁第三節(jié)結(jié)束點擊返回 第44頁第44頁第四節(jié) 大分子結(jié)合修飾一、 概念二、 大分子

10、結(jié)合修飾辦法三、 大分子結(jié)合修飾作用第45頁第45頁一、 概念利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶空間結(jié)構發(fā)生一些精細改變，從而改變酶特性與功效辦法稱為大分子結(jié)合修飾法，簡稱為大分子結(jié)合法第46頁第46頁二、 大分子結(jié)合修飾辦法修飾劑選擇修飾劑活化修飾分離第47頁第47頁1、修飾劑選擇水溶性大分子。如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等PEG: 110KD。溶解度高，無抗原性，無毒 性，生物相容性好第48頁第48頁2、修飾劑活化需活化才干與酶分子側(cè)鏈基團進行反應eg. 單甲氧基聚乙二醇(MPEG) (1) 聚乙二醇均三嗪衍生物 MPEG1, MP

11、EG2。對天冬酰胺酶等氨基進行修飾 (2) 聚乙二醇琥珀酰亞胺衍生物 SS-MPEG, SSA-MPEG, SC-MPEG。pH7-10條件下對酶分子氨基進行修飾 (3) 聚乙二醇馬來酸酐衍生物 PM。其中馬來酸酐通過酰胺鍵對酶分子上氨基進行修飾 (4) 聚乙二醇胺類衍生物 對酶分子上羰基進行修飾第49頁第49頁3、修飾將活化大分子修飾劑與經(jīng)分離純化酶液以一定百分比混合，在一定溫度、pH等條件下反應。使修飾劑活化基團與酶分子側(cè)鏈基團共價結(jié)合，進行修飾第50頁第50頁4、分離經(jīng)過凝膠層析等方法，將含有不同修飾程度酶分子分開，從中取得含有很好修飾效果修飾酶第51頁第51頁三、大分子結(jié)合修飾作用提升

12、酶活力增強酶穩(wěn)定性減少或消除抗原性酶半衰期相對穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70ficoll(低分子量)-SOD14h140ficoll(高分子量)-SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350天然SOD與修飾后SOD在人體血漿中半衰期第52頁第52頁第四節(jié)結(jié)束概念 大分子結(jié)合修飾辦法 大分子結(jié)合修飾作用修飾劑選擇修飾劑活化修飾分離提升酶活力增強酶穩(wěn)定性減少或消除抗原性第53頁第53頁第四節(jié)結(jié)束點擊返回 第54頁第54頁第五節(jié) 金屬離子置換修飾及物理修飾一、 金屬離子置換修飾二、 物理修飾第55頁第55頁一、 金屬離子置換修飾1、 概念 把酶分子中金屬離子換成另一個金屬離子，

13、使酶特性和功效發(fā)生改變修飾辦法，稱為金屬離子置換修飾第56頁第56頁一、 金屬離子置換修飾2、 辦法 酶分離純化 除去原有金屬離子 加入置換離子加入金屬螯合劑(EDTA)，形成螯合物，透析、超濾、分子篩層析等除去普通都是二價金屬離子。比如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等只適合用于哪些在分子結(jié)構中本來含有金屬離子酶第57頁第57頁一、 金屬離子置換修飾3、 作用 闡明金屬離子對酶催化作用影響提升酶活力增強酶穩(wěn)定性改變酶動力學特性第58頁第58頁二、 物理修飾1、 概念 通過各種物理辦法使酶分子空間構象發(fā)生一些改變，從而改變酶一些特性和功效辦法，稱為酶分子物理修飾第59

14、頁第59頁二、 物理修飾2、 作用 了解在不同物理條件下，因為酶分子空間構象改變而引發(fā)酶特性和功效改變情況探索極端環(huán)境中生物生存可能性及其潛力提升酶催化活性，增強酶穩(wěn)定性，改變酶催化動力學特性第60頁第60頁二、 物理修飾3、 特點 不改變酶組成單位及其基團，酶分子中共價鍵不發(fā)生改變。只是副鍵發(fā)生一些改變和重排可在一些變性劑作用下，首先破壞酶分子原有空間構象，然后在不同物理條件下，使酶分子重新構建新空間構象第61頁第61頁第五節(jié)結(jié)束金屬離子置換修飾 物理修飾概念辦法作用概念作用特點第62頁第62頁第五節(jié)結(jié)束點擊返回 第63頁第63頁第六節(jié) 酶化學修飾應用 一、 在酶學研究方面應用二、 在醫(yī)藥方

15、面應用三、 在工業(yè)方面應用四、 在有機介質(zhì)酶催化反應中應用 化學修飾辦法不足第64頁第64頁一、 在酶學研究方面應用 酶活性中心研究 酶空間結(jié)構研究 采用含有熒光特性修飾劑，可借助熒光光譜研究，分析各基團在酶分子中空間分布情況 采用巰基修飾劑，可理解酶分子中半胱氨酸數(shù)目及分布情況，擬定肽鏈數(shù)目和二硫鍵數(shù)目 酶作用機制研究 理解各種殘基及側(cè)鏈基團在酶催化過程中作用 慣用修飾辦法有親和標識法、差別標識法、氨基酸(核酸)置換法等第65頁第65頁二、 在醫(yī)藥方面應用 減少或者消除酶抗原性 增強醫(yī)藥用酶穩(wěn)定性(半衰期延長) 改變組織分布 酶經(jīng)化學修飾后，能在血液中被靶器官選擇性地吸取第66頁第66頁三、 在工業(yè)方面應用 提升工業(yè)用酶活力 增強工業(yè)用酶穩(wěn)定性 改變酶動力學特性第67頁第67頁四、 在有機介質(zhì)酶催化反應中應用經(jīng)側(cè)鏈基團修飾，酶分子能溶解于有機溶劑，均勻分布于溶劑中，提升酶催化效率和穩(wěn)定性eg. 用MPEG對脂肪酶、過氧化氫酶、