腦力智寶對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

1、腦力智寶對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響【摘要】目的研究腦力智寶對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法結(jié)扎實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作腦缺血模型，rris水迷宮法測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶功能，HE染色法觀察其神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞。結(jié)果腦力智寶能顯著縮短實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠的逃避埋伏期，增加跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)；顯著減少頂葉皮層及海馬A1區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)論腦力智寶對(duì)腦缺血損傷所致學(xué)習(xí)記憶功能減退具有改善作用，可能與其能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。【關(guān)鍵詞】腦力智寶腦缺血學(xué)習(xí)記憶細(xì)胞凋亡Abstrat:bjetiveTbservetheeffetsfNalizh

2、iba(NLZB)nlearninganderyandneurnapptsisferebralisheiarats.ethdserebralisheiadelinratsasestablishedbyligatingthebilateralnartidarteries.rrisaterazetestasappliedtdeterinethelearninganderyability.ThebraintissuefratsastakenfrrphlgialbservatinusingHEstain,andTUNELassayasappliedtdetetapptsisellsinbrain.Re

3、sultsrrisaterazetestshedthatNLZBbviuslyshrtenedtheesapelatentperid,inreasedthetiesftraversingflatrf,andreduedtheappttiellsinerebralrtexandhippapalA1regin.nlusinNLZBaniprvelearninganderyferebralisheiarats,andtheehanisightbereduingtredueappttiells.Keyrds:Nalizhiba;erebralisheia;Learningandery;Apptsis腦

4、力智寶用于治療精神發(fā)育遲滯、腦癱、腦血管病后遺癥、腦外傷后遺癥、腦炎后遺癥、老年性癡呆等腦病伴發(fā)的智力和肢體功能障礙，具有一定的療效。臨床研究說(shuō)明腦力智寶能明顯改善腦堵塞后遺癥患者運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言及精神方面的病癥1。離體細(xì)胞研究說(shuō)明腦力智寶及其含藥血清可能通過(guò)促進(jìn)Bl-2蛋白的表達(dá)、增加細(xì)胞膜流動(dòng)性等途徑對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的P12細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用2。本實(shí)驗(yàn)觀察了腦力智寶對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，旨在說(shuō)明腦力智寶用于治療腦缺血損傷性疾病后遺癥的機(jī)理。1材料與方法1.1動(dòng)物安康istar大鼠，體重220250g，雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2藥物與試劑腦力智

5、寶由廣東高明腦病醫(yī)療醫(yī)藥研究院提供，制備成1g生藥/l供試液，灌胃前按所需濃度稀釋。尼膜同尼莫地平，nidipine,Ni片劑，德國(guó)拜耳公司產(chǎn)品，批號(hào)AGFT3。TUNEL法凋亡細(xì)胞檢測(cè)盒，德國(guó)寶靈曼公司BEHRINGERANNHEi產(chǎn)品。1.3腦缺血損傷致學(xué)習(xí)記憶障礙模型的制備3大鼠經(jīng)10%烏拉坦1g/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，行頸正中切口，別離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠同法別離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎。1.4分組與給藥將造模成功動(dòng)物隨機(jī)分為4組：模型組、尼莫地平組、腦力智寶小劑量組與腦力智寶大劑量組，每組8只，雌雄各半。假手術(shù)組大鼠8只，雌雄各半。待大鼠清醒后，尼

6、莫地平組按12g/kg灌胃給予尼莫地平混懸液；腦力智寶不同劑量組分別按小劑量4g/kg、大劑量8g/kg灌胃給予腦力智寶供試液；假手術(shù)組和模型組分別給予等容量生理鹽水，1次/d，連續(xù)30d。1.5rris水迷宮測(cè)試各組大鼠在藥物干預(yù)完畢后開場(chǎng)水迷宮測(cè)試。水迷宮由直徑130，高50圓形水池組成，水深30，水溫261，在水池壁標(biāo)明4個(gè)入水點(diǎn)，由此將水池分為4個(gè)象限，任選一象限，正中放一個(gè)直徑12，高29的平臺(tái)，沒于水下1，水面覆蓋泡沫塑料。測(cè)試包括：定位航行實(shí)驗(yàn)：歷時(shí)6d，分別從4個(gè)不同的標(biāo)記入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄在120s內(nèi)尋找平臺(tái)所需的時(shí)間逃避埋伏期。假設(shè)大鼠入水后120s內(nèi)未能

7、找到平臺(tái)，那么將其置于平臺(tái)上并停留15s，逃避埋伏期記錄為120s?？臻g探究實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)完畢后，撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄120s內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。1.6腦組織形態(tài)學(xué)觀察將進(jìn)展學(xué)習(xí)記憶才能測(cè)試后的大鼠麻醉下處死，快速斷頭取腦，浸泡于10%中性甲醛液中固定。切片進(jìn)展HE染色，光鏡下觀察拍片。普通光鏡400倍下計(jì)數(shù)海馬A1區(qū)錐體細(xì)胞層500范圍內(nèi)核完好椎體細(xì)胞數(shù)目與頂葉皮層每個(gè)視野下核完好神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)不重疊視野。1.7原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)切片經(jīng)脫蠟、水洗、蛋白酶K消化、TUNEL反響，按試劑盒指示常規(guī)操作。光鏡下觀察拍片，普通光鏡400下計(jì)數(shù)海馬

8、A1區(qū)錐體細(xì)胞層500長(zhǎng)范圍內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)目與頂葉皮層每高倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)目，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)不重疊視野。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0frinds11.5進(jìn)展重復(fù)測(cè)量方差分析與單因素方差分析。2結(jié)果2.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果在定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠的平均逃避埋伏期總體呈逐漸下降趨勢(shì)，但下降的速率不一致，各組大鼠平均逃避埋伏期的比擬見圖1。第1，4，5，6天，模型組平均逃避埋伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)P0.01。與模型組比擬，尼莫地平組第5，6天平均逃避埋伏期明顯縮短P0.01，腦力智寶小劑量組第1，4，5，6天平均逃避埋伏期明顯縮短P0.05或P

9、0.01，腦力智寶大劑量組第1，2，4，5，6天平均逃避埋伏期明顯縮短P0.01，而與假手術(shù)組比擬差異無(wú)顯著性P0.05。圖1各組大鼠平均逃避埋伏期比擬2.2空間探究實(shí)驗(yàn)結(jié)果在第7天的空間探究試驗(yàn)中，模型組大鼠多在平臺(tái)所在的象限外游泳，而其他組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡多位于原平臺(tái)所在象限，各組大鼠跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)比擬見表1。與假手術(shù)組比擬，模型組大鼠跨越原平臺(tái)位置次數(shù)明顯減少(P0.01)；尼莫地平組、腦力智寶小劑量組和大劑量組大鼠跨越原平臺(tái)位置次數(shù)較模型組明顯增加(P0.01)。表1各組大鼠在空間探究試驗(yàn)中跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)2.3腦組織形態(tài)學(xué)觀察模型組大鼠大量神經(jīng)細(xì)胞壞死或嚴(yán)重皺縮，體積變小，胞核

10、與胞漿界限不清，血管、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙擴(kuò)大。各給藥組大鼠壞死神經(jīng)細(xì)胞顯著減少，零星可見一些損傷細(xì)胞，海馬椎體細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)、排列根本正常。見圖29。各組大鼠頂葉皮層與海馬A1區(qū)核完好神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比擬結(jié)果見表2。與假手術(shù)組比擬，模型組頂葉皮層與海馬A1區(qū)核完好神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少P0.01；與模型組比擬，尼莫地平、腦力智寶小劑量與大劑量均能顯著改善不完全腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞壞死與喪失P0.05或P0.01。2.4TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞結(jié)果不完全腦缺血損傷30d后，腦組織中已有大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色，陰性細(xì)胞為淡藍(lán)色。凋亡細(xì)胞有的呈散在分布，也有呈灶狀分布，可能系壞死灶

11、。見圖1017。各組大鼠頂葉皮層與海馬A1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量比擬結(jié)果見表3。與模型組比擬，尼莫地平、腦力智寶小劑量與大劑量均能顯著減少不完全腦缺血損傷后頂葉皮層及海馬A1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量P0.05或P0.01。表2各組大鼠頂葉皮層與海馬A1核完好神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的比擬表3各組大鼠頂葉皮層與海馬A1凋亡細(xì)胞數(shù)量的比擬3討論大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎能造成學(xué)習(xí)記憶障礙，是一種簡(jiǎn)便易得、比擬理想的研究腦缺血后神經(jīng)損傷及智能障礙的動(dòng)物模型3，4。腦缺血后以神經(jīng)元為主的細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷中重要的病理生理過(guò)程，其特點(diǎn)是主要分布在腦堵塞的邊緣區(qū)域，多為遲發(fā)性，干預(yù)缺血后凋亡過(guò)程有助于治療腦缺血性損傷5。腦力智寶

12、主要由當(dāng)歸、紅花、遠(yuǎn)志、石菖蒲、黃精、益智仁、龜甲、枸杞子、核桃仁等組成。方中當(dāng)歸、紅花養(yǎng)血活血，破淤散結(jié)；石菖蒲、遠(yuǎn)志化痰開竅；黃精、益智仁益氣健脾；龜甲、枸杞子、核桃仁平補(bǔ)腎陰腎陽(yáng)，益髓填精?，F(xiàn)代藥理研究資料說(shuō)明，當(dāng)歸能抑制Bax蛋白的表達(dá)，減少腦缺血區(qū)細(xì)胞凋亡的發(fā)生6；紅花可以減少腦堵塞體積，在腦缺血損傷急性期可增加神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白bl-2的表達(dá)而減少aspase-3的表達(dá)7；遠(yuǎn)志、黃精、益智仁可以改善學(xué)習(xí)記憶功能810；石菖蒲可通過(guò)增強(qiáng)突觸可塑性，改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能11，石菖蒲揮發(fā)油可以有效抑制腦缺血-再灌注后興奮性氨基酸Glu、Asp、GABA含量的異常升高，抑制大鼠腦皮質(zhì)

13、和海馬神經(jīng)細(xì)胞Bax基因表達(dá)，增強(qiáng)Bl-X基因的表達(dá)，從而抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷12，13。本研究說(shuō)明在雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致腦缺血損傷30d后，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退，大量神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡。經(jīng)腦力智寶治療的腦缺血損傷大鼠那么學(xué)習(xí)記憶功能顯著改善，凋亡細(xì)胞顯著減少。既往研究說(shuō)明腦力智寶可以通過(guò)抗氧化作用、a2+拮抗作用、促進(jìn)Bl-2蛋白的表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而抑制N誘導(dǎo)的P12細(xì)胞凋亡2。因此，腦力智寶拮抗腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與其抑制興奮性氨基酸與N的神經(jīng)毒性作用、調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。減輕腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能是腦力智寶改善腦缺血損傷大

14、鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制之一。本研究為腦力智寶用于治療腦缺血損傷性疾病后遺癥提供了實(shí)驗(yàn)根據(jù)。【參考文獻(xiàn)】1瞿瀘.腦力智寶治療腦梗死后遺癥的療效觀察J.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2022,28(2B)：51.2包金風(fēng)，李錦明，包金云，等.腦力智寶及其含藥血清對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的P12細(xì)胞凋亡的影響J.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2022，25(根底理論研究特輯)：12.3李斌，劉匯波，郭德玉，等.雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠行為學(xué)觀察J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志,2000,10(1)：15.4劉海去，商永華，王群.雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠學(xué)習(xí)記憶才能的研究J.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2022，21(4)：275.5ThpsnB.Apptsisinth

15、epathgenesisandtreatentfdiseaseJ.Siene,1995;267(5203)：1456.6楊靜薇，田峻，鄒凡，等.當(dāng)歸對(duì)大鼠局灶性缺血腦組織細(xì)胞凋亡的作用J.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2022，25(1)：4.7羅嘉，方治平，周黎明，等.紅花注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血后梗死體積和神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白bl-2,aspase-3表達(dá)的影響J.中國(guó)中藥雜志，2022，29(10)：977.8張耀春，王立為.遠(yuǎn)志提取物對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響J.中國(guó)新藥雜志，2022，15(15)：1254.9孫隆儒，李銑，郭月英，等.黃精改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙等作用的研究J.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,18(4):286.10嵇志紅，于新宇，王輝，等.